E

T
N
ADN
A
N
I
B
M
RECO

El trmino DNA recombinante hace

referencia a la creacin de nuevas
combinaciones de segmentos o de
molculas de DNA que no se encuentran
juntas de manera natural.
Aunque el proceso gentico de la
recombinacin
produce
DNA
recombinante, este trmino se reserva a
las molculas de DNA producidas por
la unin de segmentos que provienen
de diferentes fuentes biolgicas.

Al
introducirse
este
ADN
recombinante en un organismo,
se produce una modificacin
gentica que permite la adicin
de una nueva secuencia de ADN
al organismo, conllevando a la
modificacin de rasgos existentes
o la expresin de nuevos rasgos.
La produccin de una protena no
presente
en
un
organismo
determinado y producidas a partir
de ADN recombinante, se llaman

 El proceso de produccin de un ADN

recombinante comienza con la identificacin
desde un organismo de una secuencia de ADN
de inters con el fin de propagarlo en otro
organismo que carece de la secuencia y, por
ende, del producto proteico de esa secuencia
de ADN. As se pueden producir cantidades
ilimitadas de la protena codificada por el
susodicho gen. En trminos simples, el
procedimiento consiste en:
Localizacin de genes y sus funciones.
Clonacin
del
ADN,
y
su
posterior
almacenamiento en genes.
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
Utilizacin de vectores de expresin.

PROCEDIMIENTOS BSICOS
1.

Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas

enzimas denominadas endonucleasas de
restriccin, que reconocen y cortan las molculas
de DNA por secuencias nucleotdicas especficas.

2.

Los fragmentos producidos mediante la digestin

con enzimas de restriccin se unen a otras
molculas de DNA que sirven de vectores. Los
vectores pueden replicarse autnomamente en una
clula husped y facilitan la manipulacin de la
molcula de DNA recombinante recin creada.

3.

La molcula de DNA recombinante, formada por un

vector que lleva un segmento de DNA insertado, se
transfiere a una clula husped. Dentro de esta
clula, la molcula de DNA recombinante se replica,
produciendo docenas de copias idnticas conocidas
como clones.

4.

Al replicarse las clulas husped, las clulas

descendientes heredan el DNA recombinante,
crendose una poblacin de clulas idnticas, que
llevan todas la secuencia clonada.

5.

Los segmentos de DNA clonados pueden

recuperarse de las clulas husped, purificarse y

FABRICACIN DEL
ADN RECOMBINANTE

El desarrollo de las tcnicas de DNA recombinante ofrece

nuevas oportunidades para la investigacin, ya que simplifica la
obtencin de grandes cantidades de DNA que codifican genes
especficos, y facilita las investigaciones de la organizacin,
estructura y expresin gnicas.

Esta metodologa tambin ha dado un impulso al desarrollo de

la naciente industria biotecnolgica, que est suministrando
un nmero creciente de productos al mercado. El DNA
recombinante produce grandes cantidades de copias de
segmentos de DNA especficos, incluyendo genes.

BIOTECNOLOG
A

Se dedica a la utilizacin de
organismos vivos o de sus productos
con fines prcticos.

ENZIMAS DE
RESTRICCION
La piedra angular de la tecnologa del DNA recombinante es
un tipo de enzimas denominadas endonucleasas de
restriccin. Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este
nombre debido a que limitan o previenen las infecciones
vricas degradando el cido nucleico invasor. Las enzimas de
restriccin reconocen una secuencia especfica de nucletidos
(denominada sitio de restriccin) de una molcula de DNA de
doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia.

TIPO
S

TIPO
I
TIPO
II

Corta las
cadenas de
manera
escalonada,
dentro del
sitio de
reconocimient
o.

ALGUNAS ENZIMAS DE RESTRICCIN

COMUNES, CON SUS SITIOS DE
RECONOCIMIENTO Y DE CORTE, EL PATRN
DE CORTE Y LA FUENTE DE ORIGEN.

BACTERIAS

VECTORES
Despus de unirse a un
vector o vehculo de
clonacin, un segmento
de DNA puede llegar a
entrar en una clula
husped y replicarse o
clonarse. Los vectores
son,
esencialmente,
MOLCULAS DE DNA
TRANSPORTADORAS.

PLSMIDOS

TIPOS

BACTERIFAGO
S

CSMIDOS

Para servir de vector, una molcula

de DNA debe tener unas
determinadas caractersticas
1. Debe poder replicarse independientemente junto con
el segmento de DNA que transporta.

2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas

de restriccin, presentes slo una vez en el vector.
Estos sitios de restriccin se cortan con una enzima
de restriccin y se utilizan para insertar segmentos de
DNA cortados con la misma enzima.
3. Debe
tener
algn
marcador
de
seleccin
(normalmente genes de resistencia a antibiticos o
genes de enzimas que la clula husped no tiene)
para poder distinguir las clulas husped que
transportan el vector de las que no lo contienen.
4. El vector de la clula husped debe ser fcil de
recuperar.

PLSMIDOS

Los plsmidos son molculas de DNA de

doble cadena extra cromosmicas de
origen natural que tienen un origen de
replicacin (ori+) y que se replican
autnomamente
en
las
clulas
bacterianas. Para poder utilizarlos en
ingeniera gentica, se han modificado o
diseado muchos plsmidos de manera
que contengan un nmero limitado de
sitios de restriccin y genes de resistencia
a antibiticos especficos.

El vector pBR322 fue uno de los

primeros plsmidos diseados que se
utiliz en DNA recombinante. Este
plsmido tiene un origen de replicacin
(ori+),
dos
genes
de
seleccin
(resistencia a los antibiticos ampicilina y
tetraciclina),
y
algunos
sitios
de
restriccin nicos.

Mapa de restriccin del plsmido pBR322, que muestra las

localizaciones de los
sitios de las enzimas de restriccin que cortan el plsmido por un
solo sitio. Estos

Lambda (fago
)
BACTERIFAG
OS
M13

Lambda (fago )
Lambda es un bacterifago muy utilizado en experimentos de DNA
recombinante. Se han identificado y cartografiado todos los genes de
lambda, y se conoce toda la secuencia nucleotdica de su genoma. El
tercio central de su cromosoma es prescindible, y puede reemplazarse
por DNA exgeno sin afectar la capacidad del fago para infectar clulas
y formar calvas. Se han desarrollado MS DE 100 VECTORES basados
en el fago lambda, eliminando diversas porciones del grupo gnico
central.

Para el corte del

segmento de ADN, se
utiliza una enzima de
restriccin por
ejemplo EcoRI

Pasos en la clonacin
utilizando el fago lambda
como vector. Se extrae el
DNA de una preparacin
de fago lambda y se
elimina el grupo
central de genes por
tratamiento con una
enzima de restriccin. El
DNA a clonar se corta con
la misma enzima y se liga
entre los brazos del
cromosoma de lambda.
Luego se empaqueta el
cromosoma recombinante
dentro de las protenas
del fago para formar un
virus
recombinante. Este virus
puede infectar clulas
bacterianas y replicar su

M1
Cuando M13 infecta a una clula
3

bacteriana, la cadena sencilla (cadena +)

se replica y produce una molcula de
doble cadena denominada forma
replicativa (RF). Las molculas RF pueden
considerarse similares a los plsmidos,
pudindose insertar DNA exgeno en
sitios de restriccin nicos presentes en
el DNA del fago.

Cuando se reinsertan en clulas

bacterianas, las molculas RF se replican
y producen cadenas sencillas (+), en las
que hay una cadena del DNA insertado.
La clula hace salir los clones de DNA de
cadena sencilla que produce M13, que
pueden recuperarse y utilizarse
directamente para su secuenciacin, o
como molde para alteraciones
mutacionales de la secuencia clonada.

CSMIDOS Y VECTORES
TRASBORDADORES
Los csmidos son vectores hbridos construidos utilizando
partes del cromosoma del fago lambda y de DNA
plasmdico. Los csmidos contienen la secuencia cos del
fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA
del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias
plasmdicas de replicacin y de genes de resistencia a
antibiticos, que permiten identificar las clulas husped
que los contienen. El DNA de los csmidos que contiene
insertos de DNA se empaqueta en la cpside proteica de
lambda para formar partculas fgicas infectivas. Una vez
el csmido entra en la clula husped, se replica como un
plsmido.
Puesto que la mayora del genoma de lambda se ha
delecionado, los csmidos pueden transportar insertos de
DNA mucho ms grandes que los que lambda puede llevar.
Los csmidos pueden transportar casi 50kb de DNA
insertado, mientras que los vectores fgicos pueden
acomodar insertos de DNA de unas 15kb y los plsmidos
generalmente estn limitados a insertos de 5-10kb.

El csmido pJBS contiene un origen

de replicacin bacteriano (ori), un
solo sitio
cos, un gen de resistencia a
ampicilina (ampR, para seleccionar
las colonias que
han incorporado el csmido), y una
regin que contiene cuatro sitios de
restriccin
para la clonacin (BamHI, EcoRI, ClaI
y Hindlll). Puesto que el vector es
pequeo
(5,4kb de longitud), puede aceptar
segmentos de DNA exgeno de 33 a
46kb de
longitud. El sitio cos permite que el
csmido que contenga un inserto
grande se
empaquete con protenas de cubierta
vrica de lambda como si fuesen
cromosomas
vricos. Las cubiertas vricas que
contienen un csmido pueden
utilizarse para
infectar clulas husped adecuadas,
y el vector, que transporta el inserto

Pasos en la
clonacin
utilizando
csmidos como
vectores.