Cromatografía

Anlisis Cromatogrfico
La Cromatografa permite no solo

separar los componentes de una
muestra, sino tambin su
identificacin y su cuantificacin
Anlisis Cromatogrfico Cualitativo
Est basado en la medida de los

tiempos y volmenes de retencin
Anlisis Cuantitativo
Est basado en la medida de las alturas

u reas de los pic cromatogrficos
estableciendo su relacin con la
concentracin
Anlisis Cromatogrfico Cualitativo
Parmetros cromatogrficos:
Procedimiento
tR - v R
Estos parmetros se comparan con los
obtenidos por una muestra patrn
Inconvenientes
La
imposibilidad
de
asegurar
la
reproducibilidad en las medidas de tR y vR
Por ello es preferible utilizar valores
relativos: uso de patrones internos, sea
un estndar presente en la muestra o sea
agregado a la muestra
Anlisis Cualitativo
Retenciones relativas:
t'
t
i , std
t'
v'
x
std
v'
std
k'
k
std
Aplicaciones de la Cromatografa
Informacin cualitativa
no hay seguridad en la identificacin

hay evidencia en la ausencia de ciertos
constituyentes
la informacin espectroscpica se fortalece si
se realiza una cromatografa previa.
Anlisis Cromatogrfico
Cuantitativo
La respuesta del detector depende de la

sustancia por lo que se requieren
estndares
Primero se deben obtener los pic
totalmente resueltos, y
Establecidos los parmetros cualitativos
Si la respuesta del detector es la altura

del pic, se puede asumir que ella es
proporcional a la concentracin
Ventajas: sencillez, facilidad de clculo
Desventajas: la altura es ms variable, y
solo es aplicable a columnas capilares
Si la respuesta del detector es el rea del

pic, se asume que ella es proporcional a la
concentracin
Ventajas: existen muchas formas para
calcularla, programas computacionales, etc..
Desventajas: el rea requiere de una gran
definicin de los pic, tanto de forma como
su resolucin
Informacin cuantitativa
Se basa en la informacin comparativa de las
alturas o del rea de los pic con la de uno o
ms estndares.
Estos parmetros varan linealmente con la
concentracin
Pero las alturas de los pic varan
inversamente con la anchura del pic, por lo
que solo son tiles cuando no vara los
anchos de los pic.
Las variables que deben controlarse bien son:

temperatura
de la columna
caudal del eluyente
velocidad de inyeccin de la
muestra
Debe evitarse sobrecargar la columna
El rea del pic es

independiente del
ancho del pic, por lo
que son ms adecuadas
para comparaciones
con estndares.
Obtencin del rea:

integradores
electrnicos digitales
altura del pic por anchura media del pic
uso de planmetros
recortar los pic y obtener su peso
relativo al peso de un rea conocida.
Aplicaciones Cuantitativas de la
Cromatografa
Calibracin con estndares
composicin similar a la muestra

obtencin de las alturas o reas de los pic
representacin de las alturas o reas en funcin con
la concentracin
obtencin de la recta que pasa por el origen
problema es la incertidumbre en el volumen de
muestra, la velocidad de inyeccin, sobretodo en la
CG por la evaporacin producida en el extremo de
la aguja.
Mtodo del patrn interno

para evitar los problemas con la inyeccin
se introduce en cada estndar y en la
muestra una cantidad medida de un
patrn interno
se obtienen las relaciones entre las reas
del analito en los estndares y muestras y
las reas del patrn interno
Normalizacin de las reas:

relacin de las reas de los pic
corregidas por la diferencia de
respuestas del detector con el
rea total de todos los pic
Instrumentacin bsica para

Cromatografa
Dispositivo portador y distribuidor de la

fase mvil a travs del sistema
cromatogrfico
Sistemas de inyeccin de muestras
Columnas
Detector
Interfase analgica/digital
PC o Sistema electrnico
Instrumentacin para Cromatografa
Dispositivo portador y distribuidor de la fase

mvil a travs del sistema cromatogrfico
Uso de transporte por presin
Por compresin en gases y reguladores

Uso de bombas impulsoras en caso de lquidos
Microjeringas
Inyeccin manuales
Inyectores automticos
Dispositivos de control de volumen de inyeccin
Columnas
Empacadas
Analticas
Preparativas
Capilares
WCOT ( Wall Coated Open Tubular)
SCOT (Support Coated Open Tubular)
Quirales pticamente activas
Detector
Debe responder a una propiedad del analito o una propiedad

de la fase mvil
Debe cumplir con las propiedades de todos los detectores
instrumentales:
> sensibilidad
Respuesta lineal al analito con varios rdenes de magnitud
Respuesta instantnea, independiente del caudal de salida
Estabilidad durante la medicin
Respuesta reproducible
Respuesta selectiva
Intervalo de temperaturas de trabajo amplio: T ambiente a
350-400C
Operacin sencilla, fiable
Etc..
Interfase
Transforma las seales analgicas en seales

digitales
permite interaccin entre la operacin y el PC
Sistema electrnico
Permite el trabajo a travs de software

Automatiza y controla los parmetros de
operacin
Maneja la planilla de clculo y elabora la
informacin de salida
CROMATOGRAFA LQUIDA - CROMATOGRAFIA DE

GASES
Poderossimas tcnicas de anlisis
Se acoplan con otras tcnicas de deteccin (tcnicas hibridas: ej. CG-M, CLM, CL-ICP, etc.)
La cromatografa de gases, requiere muestras gaseosas o fcilmente
volatilizables.
El resto de muestras que no poseen esas caractersticas pueden ser analizadas
por HPLC.
Ambas tcnicas por su versatilidad, y por las diversas posibilidades que
ofrece la seleccin de la columna cromatogrfica, permiten abordar anlisis de
multicomponentes en muestras de diversa procedencia, con elevada precisin
y sensibilidad (dependiendo del detector).
Cromatografa de Gases
La CG es una tcnica cromatogrfica en que la

muestra se volatiliza y se inyecta a la cabeza de
una columna cromatogrfica.
La elucin se produce por el flujo de una fase
mvil de gas inerte.
A diferencia de otras cromatografas, la fase
mvil no interacciona con el analito su funcin es
transportar el analito a travs de la columna.
Existen dos tipos de CG:
GSC Cromatografa Gas Slido

Fase estacionaria un slido
Mecanismo de separacin es adsorcin
GLC Cromatografa Gas Lquido, la ms

usada (GC)
Fase estacionaria molculas de lquido

inmovilizadas en una superficie slida inerte
Instrumentacin
Gas portador
Sistema de inyeccin de muestra
Columnas y sistemas de control de
temperatura
Detectores
Sistema lector
Instrumentacin para la
Cromatografa Gaseosa
CROMATOGRAFIA GASEOSA
APLICACIONES
Qu mezclas pueden ser separadas por CG ?

cualquiera sustancia que puede ser
arrastrada por un flujo de un gas en el que
debe disolverse, al menos parcialmente
Mezclas cuyos constituyentes sean
VOLTILES (=evaporados)
DE FORMA GENERAL:
CG es aplicable para la separacin y anlisis de mezclas
cuyos constituyentes tengan PUNTOS DE EBULICIN
menores de 300oC y que trmicamente sean estables.
Gas portador
Gas inerte: He A N2 CO2 H2
En cilindros normales o Generadores de gases

Con sistemas de manmetros y reguladores de
flujo que deben mantener un flujo constante y
estable
Uso de sistemas de deshidratacin del gas,
tamices moleculares, para eliminar impurezas
Gas portador
Alimentacin de gases
Componentes necesarios
Controladores de flujo/presin del gas

Dispositivos para purificar el gas (trampas)
2
1
5
1. Cilindro
2. Regulador de presin primario
3. Trampas para eliminar impurezas
4. Regulador de presin secundario
5.Regulador de flujo (controlador diferencial de flujo)
6. Medidor de flujo (rotmetro)
Tubos y conexiones en acero inoxidable o cobre
Gas portador
La regulacin de la presin del gas se realiza

mediante un manmetro situado a la salida del
cilindro de gas y otro regulador a la entrada del
cromatgrafo:
Presiones de entrada entre 10 25 psi para caudales

de 25 150 mL/min en columnas de relleno y de 1
25 mL/min en columnas capilares
El caudal puede medirse con un rotmetro o medidor
de pompas de jabn
Diagrama de un cromatgrafo de
Gases
Propsitos del gas portador o fase mvil
Transportar los componentes de la muestra

a travs de la columna cromatogrfica, y
crear una matriz adecuada para el detector
Condiciones que debe cumplir el gas

portador o fase mvil
Debe ser inerte para evitar interacciones con la

muestra, con la fase estacionaria y la superficies
del instrumento
Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa
Debe ser puro, exento de impurezas que puedan
degradar la fase estacionaria
Adecuado para el detector a utilizar
Econmico, etc..
Gas portador
Impurezas tpicas en gases y sus efectos
H2O, O2
incompatible con DCE
oxida/ hidroliza algunas FE
Hidrocarbonatos
provoca ruido y no da
seal de DIC
Gas portador
Costo
COSTO
Gases de muy alta pureza generalmente son

de ms alto costo
C
B
A
PUREZA
A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
Gas portador
Compatible con el detector
Cada detector demanda un determinado gas

de arrastre
DCT
He , H2
DIC
N2 , H2
DCE
N2, Ar + 5% CH4
Dispositivos de inyeccin de
muestras
t=0
t=x
Los dispositivos para inyectar, inyectores o

vaporizadores, deben proveer la mejor
forma de introducir instantneamente la
muestra a la columna cromatogrfica
Inyeccin instantnea
t=0
t=x
Inyeccin lenta
t=0
t=x
Inyector en columna convencional

1
3
4
1. Septo (silicona)
2. Alimentador de gas
de arrastre
3. Block metlico de
calentamiento
4. Punta de la
columna
cromatogrfica
Inyeccin en columna de lquidos

1
La punta de la microjeringa es introducida al inicio de la

columna
La muestra es inyectada y vaporizada instantneamente al
inicio de la columna
El tapn de vapor de muestra es forzado por el gas de
arrastre a fluir por la columna
Parmetros de inyeccin
Temperatura del inyector:
Debe ser lo suficientemente elevada para que
la muestra se vaporice inmediatamente sin
descomponerse
Regla General: Tiny=50C sobre la
temperatura de ebullicin del componente
menos voltil
Parmetros de inyeccin
Volumen inyectado
Depende del tipo de columna y del estado fsico de la
muestra
Columna
Muestras
lquidas
Muestras gaseosas
Empacada
0.2 L....20L
0.1 mL....50 mL
0.01L....3 L
0.001 mL...0.1mL
= 3.2 mm
Capilar
= 0.25 mm
Las muestras slidas se disuelven en un solvente adecuado y se inyectan

como solucin
Sistema de inyeccin de muestras
La inyeccin de muestra es un punto crtico, por

una parte debe inyectarse una cantidad adecuada y
debe introducirse como un tapn de vapor lo ms
rpido posible para evitar ensanchamientos de las
bandas cromatogrficas
Una microjeringa introduce la muestra y analito en
una cmara u horno de vaporizacin instantnea
El horno est a 50C sobre el p. eb. del
componente menos voltil y est sellada por una
tapa de goma silicona, septa o septum
Para reproducir el tamao de la muestra inyectada

se pueden usar sistemas de vlvulas de inyeccin
de seis vas, donde la cantidad inyectada viene
determinada por el tamao del bucle o loop
El volumen de inyeccin depende de las
columnas:
Columnas empacadas unos 20 L

Columnas capilares menores a 10 L, para obtener
estas cantidades se utiliza un divisor de flujo a la
entrada de la columna, split-splitess
En caso de muestras slidas, se deben

introducir en disolucin
En casos de muestras que se alteran por el
calor, stas deben ser disueltas y los
analitos transformados en compuestos
fcilmente vaporizables para que puedan
ser inyectados, si esto no es posible no
pueden ser separados
Microjeringas para inyeccin
Lquidos: capacidades tpicas: 1 L , 5 L

y 10 L
Microjeringa de 10 L:
aguja (acero inox)
mbolo
cuerpo (pyrex)
Microjeringas para inyeccin
Microjeringa de 1 L
Microjeringa de 1 L (secin ampliada):

cuerpo
aguja
guia
mbolo (hilo de acero)
Esquema de un puerto de inyeccin por vaporizacin

instantnea tpico
(a) Vlvula rotatoria con seis puertos

(b) vlvula de placa deslizante
Mtodos de Inyeccin
Las columnas capilares tienen capacidad para pequeas
cantidades de muestras en comparacin con las
empacadas: 1/100 con 1/1000
Los mtodos utilizados para reducir el tamao de la
muestra son:
Inyeccin Split
Inyeccin Splitless/Split
Sistema de Inyeccin
Sobrecargar la capacidad del inyector

Si se introduce
mucha muestra puede
sobrecargar la lnea.
Puede perderse parte
de la muestra por la
salida de purga.
Ud debe cuidar que el
volumen de muestra
sea menor que el
volumen de la lnea.
Inyeccin Split
La dificultad de introducir volmenes menores que
1 L directamente.
Una manera para lograrlo es dividir la muestra
despus de la inyeccin, reduciendo el volumen total
que entra a la columna.
Despus de la volatilizacin y mezcla con el gas carrier
parte del flujo puede ser directamente eliminado por
el conducto de ventilacin Split.
Solamente una fraccin de la muestra entra en la columna
Modo Split
Relacin Split
Flujo vent split + flujo columna

Relacin = ---------------------------------------flujo columna
Inyeccin Splitless
La inyeccin Split es mejor cuando se tienen altos
niveles de solutos de inters.
Para anlisis de trazas, la inyeccin Splitless puede
usarse.
Dos aproximaciones:
Splitless: toda la muestra entra en la columna
Splitless/Split: o Inyeccin de Grob, remueve
selectivamente el solvente.
Inyeccin Splitless
Simplemente colocar split en off e introducir enteramente
la muestra.
Es muy inconveniente para la columna y da resultados
pobres.
La gran cantidad de solvente puede saturar la columna y
la fase mvil.
Splitless/Split
Llamada tambin inyeccin de Grob.

Es un proceso de dos pasos
Inyeccin inicial bajo condiciones splitless

Cambiar a modo split despus de un perodo fijado
tiempo de purga.
El propsito es introducir la mayora de los

componentes de la muestra, pero no el solvente
Inyeccin
Paso 1: purga off modo splitless
Paso 2: purga on
Modo split
Cmo Trabajar?
El solvente debe ser ms voltil que cualquiera de los
componentes de inters.
La temperatura inicial de la columna debe ser 5 10 C
bajo el punto de ebullicin del solvente.
El puerto de inyeccin debe estar lo suficientemente caliente
para volatilizar todos los componentes de inters.
Bajo estas restricciones, solamente una pequea porcin de
solvente entrar en la columna pero actuar para recoger y
centrar los solutos.
Retencin en espacios vacos intermedios
Puerto de Inyeccin de Temperatura Programable
Jeringas
Estilos
Aguja fija
Aguja renovable
Agujas de distinto largo y ngulos
Volmenes de muestra desde 1L y mayores
Recargable
Sistema a travs de un mbolo
Mtodos de inyeccin
La causa mayor de imprecisin de la

tcnica
Inyeccin automtica y manual estn
disponibles.
Si tiene automtico, selo. Si no, mientras
ms practicas realiza ms puede reducir el
error por inyeccin.
Inyeccin manual con jeringas comunes
lenta
rpida
Inyeccin con jeringas
Cuando se usa una jeringa, Ud. ve cuanta muestra

hay en el cuerpo de la jeringa pero no en la aguja.
Durante la inyeccin, parte de la muestra puede
volatilizarse en la punta de la aguja, causando
mayor imprecisin.
Esto puede provocar discriminacin entre los
componentes de la muestra, esto es peor en las
inyecciones en las columnas capilares.
Mtodos de Inyeccin
Columnas y hornos de columnas
Generalmente son:
Capilares o tubulares
Empacadas o de relleno
Normalmente son:
De 2 a 50 m de longitud
Construidas de acero inoxidable, vidrio, slice
fundida o tefln
Enrolladas en forma helicoidal con de 10 a 30
cm, segn tamao del horno de columna
Columna Empacada
COLUMNAS CAPILARES
Tipos de columnas
Empacadas
Capilares
Columnas Capilares
a) Dimensiones tpicas de las columnas capilares o

tubulares abiertas usadas en GC
b) columna cromatogrfica de slice fundida. El del
rollo es de 20 cm y la longitud tpica de las columnas es
entre 15 y 100 m
Columnas Capilares
c) Seccin transversal de columnas de pared recubierta de

fase estacionaria lquida, slida y de capa porosa
Fases Estacionarias
Lquidos depositados sobre una superficie de

slido poroso inerte (columna empacada) o
En tubos finos de material inerte (columnas
capilares)
FE
lquida
SUPORTE
Slido inerte
poroso
Tubo capilar de
material inerte
Fases Estacionarias
Para minimizar la prdida de FE lquida

por volatilizacin, normalmente el soporte
es:
Entrecruzada:las cadenas
polimricas no estn
quimicamente ligadas
entre si
Quimicamente ligadas: las

cadenas polimricas estn
presas al soporte por ligaduras
qumicas
Fases Estacionarias
Slidos:
Columnas rellenas con material finamente
granulado (empacadas), o
depositado sobre la superficie interna del
tubo (capilar)
Fases Estacionarias
Caractersticas :
Selectiva: debe interactuar diferencialmente
con los componentes de la muestra
FE Selectiva:
separain
adecuada de los
constituyentes de la
muestra
FE poco Selectiva:
mala resolucin an
con una columna de
buena eficincia
Fases Estacionarias
Caractersticas de una FE ideal

Amplio rango de temperaturas de uso
Mayor flexibilidad para optimizar la separacin
Buena estabilidad qumica y trmica
Mayor durabilidad de la columna, no reaccionar

con los componentes de la muestra
////
Fases Estacionarias
Poco viscosa
Columnas ms eficientes: menor resistencia a la

transferencia del analito entre las fases
Disponible con elevado grado de pureza
Columnas reproducibles: ausencia de picos

fantasmas en los cromatogramas
Soporte y Fases Estacionarias
Soporte y Fases Estacionarias
Como la temperatura es una variable importante

en la separacin de los diferentes analitos, el
horno de columna debe permitir:
Ajustar la T con una precisin de dcimas de grado

Ajustar la T a valores semejantes al punto de
ebullicin del analito o ligeramente superiores
Usar rampas de temperaturas cuando hay varios
analitos con distintos p. eb.
Es recomendable:
Utilizar temperaturas bajas para la elucin,

para evitar descomposicin del analito
Uso de temperaturas bajas para disminuir
riesgos de alteracin de la fase estacionaria
o de la columna
No olvidar que las columnas soportan hasta
ciertas temperaturas, generalmente
alrededor de 300C.
Polietilenglicol: muy polar, sensibles a la humedad y oxidacin

Carbowax, Supelcowax, HP-Wax, etc..
Columna: 4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH

TCOL: 200C (isotrmico) Gs de Arraste: N2 @ 20 mL./min
Detector: FID
Muestra: 0,01 mL de mezcla de aminas
Seleccin de columnas
Por grosor da la capa estacionaria

Dimetro interno de la columna
Largo de la columna
Polaridad de la fase estacionaria
Seleccin de columnas
Para muestras simples, columnas empacadas

Muestras complejas, seleccionar columnas que
mejor refleje la polaridad total de la muestra.
Para trabajos comunes, generalmente es mejor
utilizar columnas con dimetro interno pequeo y
pelcula fina de fase estacionaria
Cuidado de las Columnas
La columnas parecen firmes y fuertes, pero tiene un

tiempo de uso limitado
La capa de poliamida ayuda a reducir bastante la tensin
de la slice fundida.
Si la capa esta daada, la columna simplemente se
romper.
Esta es la forma de las columnas terminan.
Si la capa se contamina, se desgastar y desnivelar la fase
estacionaria
Pequeos trucos pueden aumentar la vida de la columna si
se hacen adecuadamente.
Cuidado y Mantencin de las Columnas
Acondicionarse antes de su uso
Nuevas: pasar solvente para eliminar trazas

residuales
Usadas: eliminar posible incorporacin de aire
durante almacenaje
Unir la columna al puerto de inyeccin, dejando sin
unir al detector
Presurizar la columna y comprobar si hay flujo
Aplicar rampas de temperaturas bajas, 50 a 100 C,
durante toda la noche
Cuidado y mantencin de las Columnas
Otras consideraciones
Evite usar grandes cantidades de muestras y
modo inyeccin splitless
Si Ud. observa prdidas de resolucin de la
columna, intente cortar un pequeo trozo en los
inicios de la columna, remover algunos
contaminantes.
Lavado con solvente puede utilizarse como
ltimo recurso
Detectores para GC
Detectores de conductividad trmica
Mide la conductividad trmica del gas

portador, ocasionada por las sustancias
eluidas
Detector de ionizacin de llama
Basado en la medidas de las corrientes de

ionizacin en una llama oxgeno-hidrgeno
debido a la presencia de sustancias eluidas
Detectores para GC
Detectores de captura electrnica
Detector de emisin de llama
Basado en la electronegatividad de las

sustancias eluidas, y su habilidad para formar
iones negativos por captura de electrones
Basado en la medida de la intensidad de la
emisin molecular de la fluorescencia de
heterotomos en las molculas orgnicas
Detector de Espectrometra de masas
Detector de Ionizacin de llama FID
Detector de Ionizacin de llama FID
FID y TCD
Detectores
para
GC:
Detector de Emisin Termoinico TED
Detector DCE
Detector de Captura Electrnica DCE
Detector de Conductividad Trmica TCD
Comparacin entre una cromatografa (a) isoterma y (b) con temperatura

programada. La muestra es una mezcla de alcanos lineales que se pasa a travs
de una columna de 1,6 mm de y 6 m de L con He 10 mL/min.
La sensibilidad en (a) es 16 veces mayor que en (b)
ACCESORIOS CROMATOGRFICOS
Cromatografa Lquida
CL - LC
Cromatografa Lquida
La cromatografa lquida clsica se lleva a

cabo en una columna de vidrio, la cual est
rellena de fase estacionaria, luego se
siembra la muestra en la parte superior y se
hace fluir la fase mvil a travs de la
columna por efecto de la gravedad.
Cromatografa Lquida
Con el objeto de mejorar la eficiencia en

las separaciones, el tamao de las
partculas de la fase estacionaria se fue
disminuyendo hasta el tamao de los
micrones, lo cual gener la necesidad de
utilizar altas presiones para lograr que
fluya la fase mvil, de esta manera naci la
tcnica de HPLC.
Tipos de cromatografa lquida
Cromatografa de particin: para especies

poco polares pero no inicas
Cromatografa de adsorcin: se aplica a
especies no polares, ismeros estructurales,
grupos de compuestos
Cromatografa inica: para especies inicas
Cromatografa de exclusin: para solutos
de masas moleculares mayores a 10 000
Cromatografa Lquida de Alta

Resolucin
HPLC
Cromatografa lquida HPLC
Uno de las tcnicas ms utilizadas hoy por su:

gran sensibilidad
Capacidad para proporcionar determinaciones
cuantitativas exactas
Permite separar sustancias no voltiles o
termolbiles
Gran aplicacin en la industria
Gran campo de aplicacin
Gran campo de aplicacin:
Plaguicidas
Hidrocarburos
Aminocidos
Protenas
cidos nucleicos
Azcares
Drogas
Terpenoides
Etc..

Eficiencia de la columna en HPLC
Todos los aspectos generales vistos previamente
sobre el ensanchamiento de los pick en la
cromatografa en columnas toman mayor
relevancia en la LC, donde se destacan:
El efecto del tamao de la partcula de relleno de la

columna
El ensanchamiento extracolumna
Efecto del tamao de muestra
El efecto del tamao de la partcula de

relleno de la columna
La eficiencia de una columna de HPLC

debera mejorar si disminuye el tamao de las
partculas de relleno, experimentalmente se
han obtenido reducciones del ancho de banda
de diez y > cuando el tamao de las partculas
ha disminuido unas 8 veces ( ej: de 45 a 6
m)
Corresponde al ensanchamiento de la banda

cromatogrfica fuera de la columna durante el
transporte de la muestra:
a travs de los tubos de los sistemas de inyeccin,

A travs de los detectores
A travs de los conectores del sistema
r u
H ex
24 DM
2
Ocurre por las distintas velocidades de flujo que

existen en los lquidos si estn cerca de las paredes
de los tubos o estn en el centro, la porcin que se
encuentra al centro del tubo se mueve con ms
rapidez que las de la perisferia.
Esto es ms notorio cuando se utilizan columnas de
dimetro pequeo.
El control va en la reduccin de los tubos del sistema
fuera de la columna
Efecto del tamao de muestra
Se observa una disminucin del ancho de

banda al disminuir la cantidad de muestra,
dependiente del mecanismo de separacin:
> H : reparto adsorcin
< H : rellenos con fase enlazada en fase reversa o
inversa
Cromatografa Lquida
Una de las necesidades de la

instrumentacin en la LC es lograr un
caudal de eluyente que pueda circular por
los rellenos de la columna, normalmente
entre 3 a 10 m, por lo que se requieren
altas presiones.
Cromatografa Lquida
Componentes:
Recipiente para fase mvil y tratamiento de los

disolventes
Sistema de bombeo
Columnas cromatogrficas
Detectores
Sistemas de adquisicin y tratamiento de datos
Cromatografa Lquida
Esquema probable de un
cromatgrafo isocrtico
Recipientes para fase mvil
Material:
vidrio
acero inoxidable
Puede complementarse mediante:
sistemas desgasificadores:
sonificacin, burbujear He, vaco, etc..
filtros
Fase mvil
Separacin con un solo disolvente de

composicin constante:
ELUCIN ISOCRTICA
Separacin con dos o ms disolventes con una

polaridad notoriamente distinta, cuya relacin
se va modificando gradualmente o en rampas
programadas:
ELUCIN CON GRADIENTE
Fase mvil
Ejemplo elucin con gradiente:

Metanol/agua
Inicio 40:60
Aumento en metanol 8%/min
Propiedades de la fase mvil
No alterar la fase estacionaria

Compatible con el detector
Disolver la muestra
Miscible con otros solventes
Baja viscosidad para reducir cadas de presin
Permitir recobrar la muestra
Pureza y estabilidad
Fcil adquisicin, econmica, etc..
Sistemas de bombeo
Requisitos:
Producir presiones estables hasta 6000 psi

Mantener el flujo libre de pulsaciones
Generar intervalos de caudales de flujo, 0,1 a
10 L/min
Control y reproducibilidad del flujo de
solvente
Componentes resistentes a la corrosin
Sistemas de bombeo
Tipos de bombas
Mecnicas
Reciprocantes, (90 %)
De desplazamiento continuo
Neumticas
Sistema de inyeccin en HPLC
Columnas
Tubos de acero inoxidable de dimetro uniforme,

empacadas que difieren en su relleno y tamao
Columnas analticas:
10 30 cm, o menores
Se pueden acoplar ms columnas
Dimetro interno 4 a 10 mm
Partculas de relleno comunes 3,5, 10 m
40 000 60 000 platos/m, o ms
Precolumnas: evita deterioro de la columna

analtica
Hornos de Columnas
Normalmente las columnas trabajan a

temperatura ambiente
Pero es posible mejorar las separaciones
utilizando temperaturas controladas hasta
0,1, permiten normalmente hasta 150C
Rellenos de Columnas
Rellenos:
Pelicular
Partculas porosas: micropartculas porosas
de dimetros entre 3 y 10 m
Rellenos de Columnas
Cromatografa de reparto:
De fase normal: la fase estacionaria de

elevada polaridad
De fase reversa o inversa: la fase estacionaria
no polar generalmente un hidrocarburo y la
fase mvil relativamente polar: ej. Agua,
metanol, acetonitrilo
Detectores
Detector de ndice de refraccin

Detector de fluorescencia
Detector UV
de longitud de onda fija

de longitud de onda variable
De arreglo de diodos
Detector electroqumico
Amperomtrico
conductimtrico
Detector de Arreglo de Diodos DAD
DAD
Imagen 3D
Sistemas de separacin
Seleccin de la columna
Seleccin de la fase mvil
Derivatizacin:
Tipos:
Precolumna
Postcolumna
Finalidad:
Para reducir polaridad de las especies

Para aumentar respuesta del detector
Para aumentar selectivamente la respuesta del detector
Problemas comunes en HPLC
presiones altas
baja resolucin
cambios en tR
Variaciones lnea base
Ruido
Pic falsos
Etc..
Trabajo
Muestras filtradas por ultramicro filtros

Desgasificadas, uso de baos de ultrasonido.
Uso de reactivos calidad cromatogrficos
Es conveniente uso de precolumnas
Como los detectores no son destructivos, es
posible realizar cromatografas preparativas

Cromatografía

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