ANTI HBS

Tes ELISA untuk deteksi antibodi

dari HbsAg di serum/plasma
manusia.

Kegunaan

Virus hepatitis adalah penyakit menular yang paling

sering disebabkan oleh virus hepatitis b yang
mempengaruhi sekitar 5 % dari populasi dunia dengan
beberapa variasi regionalpenyakit yang dapat
bermanifestasi sebagai asimtomatik, akut atau
hepatitis kronis yang bisa berdegenerasi menjadi
sirosis atau sel kanker hati dan kematian.

Penyakit ini biasanya ditularkan melalui pertukaran

cairan tubuh antara individu yang sehat dan yang
terinfeksi. jalur penularan adalah melalui jalur
parenteral (serum yang trinfeks, darah, transfusi
darah) atau non parenteral (salia, air mata, urin,
semen atau kulit.)

pengetahuan tentang ada atau tidak adanya

antibodi terhadap HBsAg dapat berguna dalam
menilai imunitas atau pemulihan klinis dari
individu yang terinfeksi HBV.
Hilangnya HbsAg dan munculnya anti-HBs
didalam serum menandakan bahwa individu
berada dalam tahap pemulihan dari infeksi HBV.
Anti - HBs dapat tetap dalam serum selama
bertahun-tahun jika dipertahankan pada tingkat
tertentu , serum anti - Hbs dapat memberikan
perlindungan yang memadai terhadap reinfeksi
oleh HBV

Prinsip

Tes anti-HBs adalah fase padat sistem enzim immunoassay yang

menggunakan metode Sandwich untuk mendeteksi antibodi anti
- HBS dalam serum , plasma atau recalcified plasma.

Sampel uji dan peroksidase terkonjugasi oleh HBsAG. jumlah

peroksidase-HBsAg konjugat yang terikat dengan baik
sebanding dengan konsentrasi anti-HBs dalam spesimen yang
bertindak sebagai penghubung antara HBsAg tetap dan HRP
terkonjugasi.

Setelah inkubasi, enzim terikat konjugat dicuci . larutan

substrat ditambahkan dan selama inkubasi berubah menjadi
warna biru .
Dengan menggunakan larutan asam, warna larutan berubah
menjadi kuning menandakan reaksi telah berhenti .

Itensitas warna kuning yang terbentuk

sebanding dengan jumlah anti - HBs hadir
dalam spesimen

Dalam batas-batas tertentu , kepadatan

optik pada 450 nm mencerminkan tingkat
anti - HBs antibodi dalam spesimen . OD
membaca kurang dari nilai cut off dianggap
negatif anti - HBs . Pembacaan OD sama
dengan atau lebih besar dari nilai cut off
concidered reaktif untuk anti HBs.

Reagen

Catatan keselamatan

Tidak menelan reagen . hindari kontak dengan mata , kulit dan

selaput lendir .

memakai pakaian pelindung dan sarung tangan sekali pakai

Semua sampel pasien dan kit kontrol harus ditangani sebagai infeksi
yang dapat ditularkan.

Kontrol negative telah ditemukan negatif bagi para pembuat hepatitis

b . kedua kontrol telah ditemukan negatif untuk anti - hiv dan antibodi
anti hvc , tambahan kontrol poitive telah dipanaskan tidak aktif

Semua bahan terkontaminasi dengan sampel pasien atau kontrol kit

harus dilemahkan oleh autoklaf ( 60 menit pada 121 C ) atau dengan
penyimpanan dalam larutan hipoklorit sodium setidaknya 60 menit.

Berhenti jika mengiritasi mata dan kulit. Jika

terjadi kontak dengan mata , bilas -benar
dengan air dan berkonsultasi dengan
dokter.
Jangan mencampur atau menggunakan
komponen kit dengan nomor lot yang
berbeda
Jangan mencampur tutup botol
Jangan menggunakan reagen yang sudah
kadaluarsaJangan menggunakan reagen dari
produsen lain bersama dengan tes ini

Stabilitas :
reagen stabil sampai dengan tanggal
kadaluwarsa apabila disimpan pada 2-8 c

Persiapan reagen :
semua reagen harus berada daam suhu
ruang sebelum digunakan. Reagen yang
tidak digunakan harus selalu disimpan di
2..8 c

Larutan Kerja Substrat (SUB)

Pipet 50 Ul masing-masing SA dan SB itu memunginkan untuk
larutan substrat bekerja. Persiapkan larutan kerja substrat
dengan mencampur SA dan SB dengan volume yang sebanding
dalam jumlah yang dibutuhkan (100 ul per well). Gunakan botol
kecil bersih yang sebelumnya dibilas dengan air suling atau
deionisasi. Larutan kerja substrat stabil untuk jam jika disimpan
pada suhu ruang dan terlindungi dari cahaya.

Larutan Cuci Kerja (WASH)

Encerkan larutan pencuci 1:20 dengan segar, bebas kuman,
suling atau deionisasi dll
50 ml larutan pencuci + 1000 ml air
Stabilitas : 1 minggu bila disimpan pada suhu 2-8 oC. hindari
adanya kontaminasi.


1.

2.

3.

4.

Strip Microtiter (MIC)

strip ditutupi dengan foil dan disegel di kantong plastic
dengan pengering,
sebelum membuka, strip harus berada di ruang suhu untuk
menghindari kondensasi di sumur dan tas .
Saat tidak digunakan kembalikan bersama pengeringnya
ke atas zip-lock dan simpan pada suhu 2-8C
Jangan menyentuh bagian atas permukaan atau bagian
bawah lubang wells dengan jari.

Spesimen
1) serum atau plasma (EDTA, Heparine, Oxalate)
2) sampel dapat disimpan selama 7 hari bila pada suhu 2-8 oC
, untuk 30 hari simpan pada suhu -20oC
3) membekukan dan mencairkan sampel sekali saja
4) spesimen yang dicairkan harus homogenhilangkan
partikulat dengan sentrifugasi atau filtrasi

Prosedur Tes

Ikuti proedur persis seperti yang dijelaskan

bawa semua reagen dan spesimen ke suhu ruang sebelum digunakan.
Ketika memulai uji ini semua spesimen dan kontrol dicatat pada
lembar kerja disertakan dengan kit
Pilih jumlah microtitter strips dan tempatkan pada tempatnya
Perhatikan perpindahan panas yang tepat selama 60 menit inkubasi
pada suhu 37oC.Tempat sumur mikrotiter diatas handuk lembab atau
balok logam dalam inkubator
Prosedur mencuci sangat penting. Mencucui yang tidak cukup akan
menghasilkan presisi rendah dan meningkatkan kesalahan
absorbansi.
Hindari cahaya yang kuat selama perubahan warna
Setiap langkah memipet harus diikuti, kocok perlahan microwell untuk
memastikan semua tercampur tanpa menumpahkan larutan.
Gelembung udara harus dihilangkan sebelum inkubasi serta membaca
absorbansi

Cara Kerja
Langkah 1:
Pipet 50ul NC masukan kedalam well B1/C1/D1 kemudian pipet 50ul
PC masukan kedalam well E1/F1 Lalu pipet 50ul sampel masukan ke
dalam semua sisa well yang masih kosong kecuali well A1
Pipet 50ul CON masukan ke semua well kecuali well A1
Sampel dan CON dicampur dengan mengayunkan well secara perlahan
selama 20 detik. Hati-hati jangan sampai isi well yang satu meluber ke
well yang lain.
Tutup MIC dengan kertas perekat (parafilm)
Inkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit
Keluarkan isi dari well dan masukan kedalam larutan sodium
hypochlorite 5% dan tambahkan 400ul WASH kedalam setiap well
setelah 30 detik.Ulangi pencucian sebanyak 5 kali. Siapkan pembersih
otomatis dengan WASH dan cuci MIC sebanyak 6 kali. Pastikan
pembersih mengisi semua well secara keseluruhan dan efisien setelah
setiap 30 detik. (sisa cairan: <15ul). Bersihkan sisa cairan dengan
tissue.

Langkah 2:
Masukan 50ul SA dan 50ul SB ke dalam semua
well termasuk well A1
Campur dan inkubasi selama 30 menit pada suhu
ruang (15-25 oC) lindungi dari cahaya yang kuat
Masukan 100ul STOP ke dalam semua well dan
campurkan secara hati-hati.
Ukur absorban tak lebih dari 30 menit terhadap
blanko yang ada pada well A1 dengan panjang
gelombang 450nm dengan rekomendasi panjang
gelombang 630-690nm (jika tersedia)

Validasi tes

Hasil tes akan benar jika memenuhi syarat dan kriteria

sebagai berikut:
Nilai mean negative control (MNC) < 0.200
Nilai mean positive control (MPC) > 0.500
MPC - MNC > 0.300
Jika hasil selisihnya lebih kecil, dapat dicurigai karena teknik
yang tidak benar. Pengujian harus diulang. Jika hasil
selisihnya tetap konsisten kurang dari 0.300, dapat dicurigai
karena kualitas reagen yang buruk
Nilai NC tak lebih dari 0.5 x MNC dan 2.0 x MNC. Jika satu
nilai berada diluar range ini, buang nilai tersebut dan hitung
ulang MNC nya. Jika dua nilai yang berada diluar range,
pengujian harus diulang.
NCi = 0.5 x MNC < MNC < 2.0 x MNC

Penghitungan:
Ada atau tidak adanya anti-HBs yaitu membandingkan nilai
absorban dari spesimen dengan nilai cut-off. Nilai cut-off
adalah hasil penghitungan dari negative control:
Nilai Cut-off (COV) = MNC + 0.025

Interpretasi Hasil:
Positif Spesimen dengan nilai absorban yang sama atau
lebih besar dari 1.1 x COV dikatakan positif anti-HBs
Negatif Spesimen dengan nilai absorban yang kurang
dari 0.9 x COV dikatakan negatif anti-HBs (non-reaktif)
Samar-samar (kurang tegas) Spesimen dengan nilai
absorban 10% dari nilai cut-off sebaiknya diuji ulang
untuk mengkonfirmasi pembacaan yang sesungguhnya

Keterbatasan prosedur:

Sistem anti-HBs ELISA terbatas untuk mendeteksi semi

kuantitatif antibodi anti-HBs dalam serum dan plasma.
Semi kuantitatif didasarkan dari membandingkan
absorban spesimen dengan absorban pengenceran PC
(dicairkan dengan NC atau HBV free serum matrix)
Seperti semua tes diagnosa, menentukan diagnosa klinik
tidak berdasarkan dari satu hasil tes, tetapi sebaiknya
hanya didapat oleh dokter setelah semua klinik dan
laboratorium di evaluasi
Seperti tes microwell yang lain, pembacaan yang tidak
tetap mungkin didapat karena pencucian yang kurang.
Oleh karena itu penting untuk benar-benar membuang isi
well semuanya sebelum menambahkan larutan reagen
pencuci

Penunjuk Cepat anti-HBs ELISA

Persiapan larutan kerja
Siapkan larutan WASH yang terdiri dari
1:19 larutan WS dan H2O terionisasi
(stabilitas selama 1 minggu pada suhu 28oC)
Siapkan larutan substrat (SUB) yang
terdiri dari 1:1 larutan SA dan SB
(stabilitas selama 2 jam pada suhu 15-25
o
C)

Distribusi control dan sampel

Pipet 50ul NC dan masukan ke dalam well B1, C1, D1
Pipet 50ul PC masukan ke dalam well E1, F1
Pipet 50ul Sampel dan masukan ke dalalm semua sisa well
yang masih kosong kecuali well A1
Distribusi conjugate (CON)
Pipet 50ul CON dan masukan ke dalam semua well kecuali
well A1
Campurkan dengan hati-hati
Tutupi dengan kertas perekat (parafilm)
Inkubasi selama 60 menit pada suhu 37 oC
Lakukan pencucian dengan larutan WASH sebanyak 6 x 400ul

Distribusi substrat (SUB)

Pipet 100ul SUB dan masukan ke dalam semua well
termasuk well A1
Campurkan dengan hati-hati
Inkubasi selama 30 menit pada suhu 15-25 oC
Penghentian
Pipet larutan 100ul STOP ke dalam semua well
termasuk well A1
Campurkan dengan hati-hati
Membaca Hasil
Ukur absorban pada panjang gelombang 450nm
secepat mungkin (tak lebih dari 30 menit)