El objetivo final es analizar los genes humanos

que codifican para el Factor IX de la

coagulacin, tanto de la forma normal como de
una forma mutante que tiene consecuencias
patolgicas (hemofilia).
As planteado, las primeras preguntas podran ser:

Genes humanos? Cules?

Qu es el Factor IX?
Qu es una forma mutante?
Qu es la hemofilia?
..?

Genes humanos? Cules?

Se estima que el genoma humano tiene unos 25000
genes, ubicados en los 46 cromosomas agrupados en
23 pares (en cada par de cromosomas, uno procede
del padre y otro de la madre).
Este nmero cromosmico es caracterstico de
nuestra especie. De estos 23 pares, 22 pares son los
llamados autosomas y el par restante lo forman los
cromosomas sexuales: XX o XY
Los genes que nos interesan estn situados en el
cromosoma X.

Aqu estn todos los cromosomas: Pero cual es el X?

Conjunto de cromosomas humanos

Para identificarlos grficamente, recurrimos a un cariotipo

Y qu importa que sea en el X o en otro cromoso

El cromosoma X tiene una baja
proporcin de genes si lo
comparamos
con
otros
cromosomas.
Esta compuesto por muchos
segmentos de ADN repetitivo que
no codifica para ninguna protena
o su funcin no es conocida. Solo
el 1,7% del cromosoma codifica
para protenas funcionales.
La herencia de estos genes est
relacionada con el sexo de los
individuos. Las mujeres (XX)
reciben dos copias de estos
genes, mientas que los hombres
(XY) solo reciben una copia.
El problema viene cuando esta

Qu es el Factor
IX?
El factor IX es una protena codificada por un gen situado en el
cromosoma X
La presencia de esta protena en la sangre ayuda a la coagulacin
de la misma cuando se produce la rotura de un vaso sanguneo.
No es la nica protena que colabora en esta
funcin: Hay otros doce factores de
coagulacin, nombrados con nmeros romanos,
pero la importancia de esta protena y la razn
por la que la vamos a estudiar es que su
ausencia o falta de actividad, provoca la
hemofilia.

Qu es una forma
mutante?

Nos estamos refiriendo en esta caso a que la protena resultante

del proceso de traduccin del gen no es la correcta y por tanto
no tiene la misma actividad que la forma normal o salvaje

En nuestro caso, la
forma normal
tapona la herida
mientras que la
forma mutante no
lo hace (hemofilia)

Por que ha sucedido esto?

Se pueden producir mutaciones por muchas causas, factores externos
(mutgenos fsicos o qumicos) o causas internas como fallos en los
procesos de transcripcin.
El resultado final es un gen con una secuencia alterada
mutacin
3

5
G C C
C G G

5
5

Cadena
molde
Cadena
codificante

C G G

ARGININA

G C C

5
AD
N

G G G
5

5 G G G

GLICINA

ARN
m
Aminocido
resultante

Aumentan la probabilidad de
supervivencia del individuo (y
de la especie)
No tienen consecuencias
evolutivas

Disminuyen la probabilidad de
supervivencia del individuo (y
de la especie)
Las mutaciones son uno de los mecanismos que aumentan la
variabilidad de las especies y son, por tanto, un motor de la
evolucin

Qu es la hemofilia?
Las personas que tienen hemofilia
hereditaria nacen con este trastorno.
La hemofilia se debe a una alteracin
en uno de los genes que determinan
la manera en que el organismo
produce el factor IX de coagulacin.

Las mujeres tienen dos cromosomas X, mientras que los varones

tienen un cromosoma X y un cromosoma Y. Slo el cromosoma X
contiene los genes relacionados con los factores de coagulacin.
Un varn que tenga el gen anormal en su cromosoma X sufrir
hemofilia.
Una mujer debe tener el gen anormal en ambos cromosomas X
para tener hemofilia. Esta situacin es muy poco comn.
La mujer es "portadora" de la hemofilia si tiene el gen anormal en
uno de sus cromosomas X. Aunque no sufra la enfermedad, puede
transmitir el gen a sus hijos.

Victoria Eugenia, nieta

de la reina Victoria, se
cas con Alfonso XIII e
introdujo la hemofilia
en la familia real
espaola

Existen diversos tipos de hemofilia. Pero la mayor parte de ellas son

debidas a mutaciones que afectan a los genes de nicamente tres
factores:
de tipo A deficiencia en el factor VIII (la ms comn,
alrededor del 80%)
de tipo B deficiencia en el factor IX
de tipo C deficiencia en el factor XI (muy rara, alrededor del
2%)
Cmo se detecta la hemofilia?

En familias en las que se conoce la existencia de la mutacin

(normalmente en los casos ms graves), una manera sencilla y
definitiva de diagnosticar la enfermedad es mirar la mutacin a nivel
molecular.

Vamos a realizar un diagnstico molecular prenatal: determinaremos

si un feto de 5 semanas tiene, o no, hemofilia tipo B.
Este dato es importante ya que la madre es
portadora de esta enfermedad y su hermano
mayor presenta una hemofilia severa de tipo B.
Dentro de este tipo de hemofilia causada
por una deficiencia en el factor de
coagulacin
IX,
se
encuentran
las
hemofilias denominadas Bm, los individuos
con esta enfermedad tienen niveles
normales de este factor y sin embargo es
inactivo ya que su actividad es inferior al
1% con respecto al individuo normal.

Esta falta de actividad es debida a una mutacin puntual

que afecta al triplete de bases (codn) que codifica para el
aminocido 180 (CGG en el gen normal, GGG en el gen
mutante).
Esta mutacin hace que la protena que se genera tenga
una secuencia de aminocidos distinta.
En este caso, como hemos visto, el cambio afecta a un
solo aminocido: tiene una arginina en vez de una glicina

Phe
178
182

Thr

Arg

Val

179

180

181

Val

secuencia del gen normal

Phe
178
182

Thr

Gly

Val

179

180

181

secuencia del gen mutado

Val

Esta sustitucin de aminocidos en la protena resultante

(arginina por glicina) impide que se produzca la hidrlisis del
enlace peptdico entre el aminocido 180 y 181. Esta rotura es
necesaria para la activacin del Factor IX.
Nt

RA

Ct

VR

145-146

181-180

normal (Arg 180)

Activacin
proteoltica completa
del Factor IX normal

Nt

RA

Ct

VG

145-146

181-180

mutado (Gly 180)

VG
181-180

Activacin
proteoltica
incompleta de la
forma mutada

20

HIDRLISIS DE UN ENLACE PEPTDICO

La mutacin producida afecta a un sitio de reconocimiento del

enzima de restriccin AvaI, que desaparece en el gen mutado.
AvaI

TTCACTCGGGTTGTT
secuencia del gen normal

AvaInoreconocelanuevasecuencia
TTCACTGGGGTTGTT
secuencia del gen mutado

Qu es un enzima de
restriccin?
Son las tijeras que se utilizan en biologa molecular par cortar
ADN.

Molecularmente, son enzimas presentes en las bacterias que

actan como sistema defensivo para evitar la infeccin de ADN
procedente del exterior (por ejemplo, ADN vrico).

El nombre de cada enzima de restriccin est asignado segn el

origen bacteriano de la misma En nuestro caso, el enzima Ava I
procede de la bacteria Anabaena variabilis

Cortan el ADN por una secuencia concreta.

Extremos cohesivos o pegajosos

ADN recombinante

Para saber si el feto sufrir la enfermedad necesitamos

confirmar si el gen que codifica para el factor IX de
coagulacin contiene o no la mutacin. Para averiguarlo
vamos
a utilizar tcnicas
de ingeniera
1. Aislaremos
el fragmento
delgentica:
gen del factor

1. Aislaremos el fragmento del gen del factor

IX mediante la tcnica de la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR, del ingls
Polymerase Chain Reaction): amplificaremos
un fragmento de aproximadamente 500 pares
de bases del gen del factor IX (el gen tiene
415 aminocidos y unos 34.000 pares de
bases).
Este fragmento que contiene la diana (lugar
de corte) para AvaI (un enzima de
restriccin) y por tanto la secuencia que
puede estar, o no, mutada.

2. Lo almacenaremos por clonaje en un plsmido

bacteriano:
El fragmento obtenido por PCR lo tendremos que
pegar a un plsmido (molcula pequea de
ADN circular que utilizan las bacterias para
diferentes misiones).
El plsmido con ADN aadido (plsmido
recombinante) hay que introducirlo en bacterias
(proceso de transformacin bacteriana) y
dejarlas crecer para aumentar la cantidad de
plsmido total.
Cada vez que se
plsmido tambin se

duplican las bacterias, el

duplica.

3. Purificaremos el plsmido del cultivo de

bacterias (todas las bacterias que obtengamos
son hijas de una nica que contena plsmido
recombinante).
Una vez purificado, lo pondremos en contacto
con el enzima de restriccin AvaI, y
analizaremos el resultado por separacin
electrofortica de los fragmentos generados.

4. Las bandas obtenidas durante la electroforesis

se analizan por tincin del ADN con un compuesto
fluorescente, y determinaremos si el gen del factor
IX del beb se ha cortado o no se ha cortado, es
decir, si su cromosoma X corresponde al sano o al
mutado de la madre.
Para poder hacer un buen diagnstico, es
importante llevar a cabo el mismo procedimiento
con muestras de al menos un individuo sano
(control negativo) y un individuo enfermo (control
positivo).

Reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR)
Es una tcnica que permite duplicar un nmero ilimitado de
veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante
esta tcnica pueden generarse millones de molculas
idnticas, a partir de una molcula de ADN y adems en muy
poco tiempo.
La reaccin es un proceso cclico:
1.La molcula de ADN que va a copiarse
se calienta para que se desnaturalice y se
separe las dos hebras.
2.Cada una de las hebras es copiada por la
ADN-polimerasa. (Se utiliza la ADNpolimerasa de una bacteria que vive en
aguas termales, Thermus aquaticus, as la
enzima puede trabajar a altas
temperaturas).
3.Las cadenas recin formadas son
separadas de nuevo por el calor y
comienza otro nuevo ciclo de copias.

Aplicaciones de la PCR

Amplificacin de:
ADN antiguos (mamuts, momias,
fsiles
ADN obtenidos de la escena de un
crimen (medicina forense).
ADN de clulas embrionarias
(diagnostico prenatal de trastornos
genticos)
ADN de genes virales (en clulas
infectadas por virus difciles de
detectar, como el VIH)

Animacin de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf

PROTOCOLO 1 (Preparacin de la reaccin de PCR):

Pipetear en un tubo eppendorf las siguientes cantidades:
Material

Cantidad

ADN (liq. amnitico) 5 l

Buffer 10x

2.5 l

Mg CL2

2 l

dNTPs

0.5 l

oligo 1

0.5 l

oligo 2

0.5 l

Taq polimerasa

0.5 l

H20

17.45l

ADN que queremos

amplificar

Mezcla de PCR

Conectar el aparato de PCR y programar de la siguiente manera:

5 min a 95C
1 min a 95C desnaturalizacin
30 seg a 55C anillamiento
30 seg a 72C elongacin
7 min a 72C

30 ciclos

Mientras tiene lugar la PCR prepararemos el gel de electroforesis para analizar los resultados

INFORMACIN TECNICA ELECTROFORESIS

El ADN es una molcula cargada negativamente ya que est
compuesta por una combinacin de cuatro nucletidos que tienen
carga negativa y peso molecular similar.
La electroforesis en agarosa permite separar molculas de ADN,
cuando stas son sometidas a un campo elctrico ya que son
atradas hacia el polo opuesto (positivo). Hay dos fuerzas de
accin opuesta que determinan la velocidad de la molcula de
ADN.
la fuerza elctrica atrae al ADN hacia el electrodo y la intensidad
de la atraccin es directamente proporcional a la carga.
la fuerza de rozamiento con el gel de agarosa se opone a la
migracin y su intensidad depende del tamao y la forma de la
partcula.

Ya que la carga de cualquier molcula de ADN es siempre

negativa, la diferencia de migracin de dos molculas de ADN de
diferente tamao y forma depender bsicamente de la fuerza de
rozamiento.
La
fuerza
de
rozamiento
la
proporciona el soporte de agarosa o
gel. La agarosa funciona como un
filtro en las que las mezclas de ADN
de diferentes tamaos migran a
travs
del
gel
de
agarosa
separndose tras un corto periodo.
La distancia migrada por una
molcula
es
inversamente
proporcional a su longitud en pares
de bases (tamao). Los fragmentos
ms
pequeos
avanzan
mayor
distancia con referencia al origen o
punto de aplicacin de la muestra.

+
Marcador
es de
tamao

Muestras
a estudiar

Los cidos nucledos separados en geles de agarosa pueden

visualizarse mediante tincin con colorantes fluorescentes, lo
cual permite evaluar su tamao con patrones de tamao
conocido o marcadores.
Los colorantes fluorescentes se insertan entre los pares de
bases que conforman el cido nucleico.
El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la
visualizacin de ADN y ARN. Sin embargo, ste es un reactivo
altamente txico, con propiedades mutagnicas, por lo que
debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio.
En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos,
como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y
Syto60, desarrollados especficamente para reducir los
riesgos potenciales de mutagnesis.

Fragmentos de ADN
teidos en bromuro de
etidio tras una
electroforesis en un gel
de agarosa

PREPARACIN DEL GEL

1.Aadir 0,5 g de agarosa a 50 ml de solucin TBE 1x.
2.Calentar a 100 C hasta que funda. Se deja enfriar hasta
aproximadamente 55 C. Aadir 20 l de solucin de Bromuro de
Etidio (BrEt) 2,5 mg/ml y mezclar bien sin producir espuma.
3.Aadir todo sobre una bandeja de electroforesis sellada con cinta y
colocar un peine y dejar que dejar que gelifique.

4. La bandeja se coloca sobre la cubeta de electroforesis. Se aade

a la cubeta tampn de electroforesis hasta que cubra el gel de la
bandeja.
5. Pipetear en el primer pocillo del gel de agarosa 10 l de
marcador de pesos moleculares conocidos, en el segundo 20 l
de ADN de la madre, en el tercero 20 l de ADN del hermano y
en el cuarto 20 l de la reaccin de PCR (ADN del feto) (10 +
10 l del tampn de muestras) en un pocillo del gel de agarosa
6. Desarrollar la electroforesis a 100 Voltios (voltaje constante).
7. Observar mediante iluminacin con luz ultravioleta, ya que el
colorante BrEt intercalado entre las bases del DNA es capaz de
emitir fluorescencia despus de absorber dicha luz ultravioleta.
8. Los geles se fotografiarn y se discutirn los resultados
obtenidos.

Tcnica de clonaje

Mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando

oligonucletidos adecuados, hemos obtenido el fragmento de inters
a partir del genoma del feto que pensamos pueda estar afectado de
hemofilia tipo Bm.
Este fragmento ha sido clonado en el vector plasmdico pUC19 y se
mantendr en el laboratorio como plsmido recombinante purificado.
En paralelo hemos clonado un fragmento del mismo gen que proviene
de un individuo sano.
Los dos son de idntico tamao, pero el que contiene el fragmento
del gen normal presenta un sitio de restriccin AvaI que no est
presente en el que contiene el fragmento del gen mutado.

Fragmento clonado
del genoma del
feto

Ava
I ???
ADN
plasmdico
pUC19

Solo existir este punto

de corte si el fragmento
clonado tiene el gen
normal.

Ava
I

Fragmento clonado
de un individuo
sano
Ava
I

ADN
plasmdico
pUC19

Ava
I

Para diferenciar que gen tenemos recombinado en el plasmido,

hacemos una digestin (reaccin con enzimas de restriccin)
con AvaI
Para saber el resultado (uno o dos fragmentos) haremos una
electroforesis en gel de agarosa.
La
digestin
de
los
plsmidos
recombinantes con AvaI dar lugar a uno o
dos fragmentos dependiendo de la
presencia o ausencia de la mutacin.
Cada grupo analizar mediante digestin
con AvaI el plsmido recombinante del feto
o del individuo normal.
El objetivo es
identificar si el feto tiene la mutacin.

Digestin con Ava I.

Si tenemos el gen normal

Obtenemos dos
fragmentos,
Uno muy grande y otro
mucho ms pequeo

Digestin con Ava I.

Si tenemos el gen mutante

Obtenemos un nico
fragmento

Plsmidos

Son molculas de ADN

bicatenario circular.
Se localizan en las bacterias.
Tienen replicacin
independiente.
Genes propios (resistencias a
antibiticos) que permiten
seleccionarlos posteriormente
Facilidad para la manipulacin.
Puntos de corte especficos
para enzimas de restriccin

INFORMACION TECNICA TRANSFORMACION

Los productos de la ligacin entre el fragmento amplificado por
PCR y el vector plasmdico pUC19 se introduce en las bacterias
por un proceso que se denomina transformacin.
Este proceso se basa en hacer a las bacterias susceptibles de
incorporar DNA exgeno mediante diversos tratamientos
qumicos (en este caso, calcio a bajas temperaturas).
El DNA exgeno pasar a la descendencia slo si este se integra
en el material gentico de la clula blanco o si el mismo tiene
un origen de replicacin (ori), que funcione en la clula diana
(este ser nuestro caso puesto que el plsmido tiene su origen
de replicacin)
A estas bacterias susceptibles de incorporar DNA exgeno las
denominamos bacterias competentes.

Estado de competencia en las bacterias

Estado fisiolgico que permite la entrada de ADN

exgeno
Puede ser natural o provocado.
Formas de provocarlo:
Tratamiento con calcio (cloruro de calcio).
Choques bruscos de temperatura.
Electroporacin

Cualquiera de estas situaciones altera la permeabilidad

celular y permite la entrada del ADN plasmdico.

Uno de los inconvenientes de la transformacin es que

estas clulas son ms frgiles y hay que manipularlas
con cuidado

De los productos de la reaccin de ligacin entre el plsmido

(vector) y los fragmentos de PCR, las bacterias competentes
podrn incorporar:
1.Vector religado consigo mismo. Los extremos cortados se
unen entre s.
2.Vector que no fue digerido por el enzima de restriccin.
3.Vector ligado al fragmento (plsmido recombinante).
4.Fragmento no ligado
5.Ninguno.
1
Se vuelven a unir los extremos

La introduccin de DNA en las bacterias es un

proceso muy ineficiente y por ello es necesario
utilizar un mtodo que nos permita identificar el
reducido nmero de bacterias que han incorporado
el plsmido que buscamos.
Con este objetivo a los plsmidos se les ha dotado
de un sistema de seleccin (gen de resistencia a
ampicilina en el caso del pUC19) que confiere a las
bacterias transformadas con plsmido un fenotipo
fcilmente diferenciable: slo las bacterias que han
incorporado el plsmido sern capaces de crecer en
presencia de ampicilina en la placa de cultivo.
Colonias de
bacterias
competentes
Medio con ampicilina

Gen de
resistencia
a la
ampicilina

Las bacterias son capaces de resistir

el antibitico gracias a la resistencia
que les confiere el plsmido
incorporado (da igual que sea un
plsmido recombinante o plsmido
sin recombinar

Adems, debemos distinguir las bacterias que han incorporado el plsmido en

el que se ha insertado el fragmento del gen del factor IX de aquellas que han
incorporado el plsmido pUC19
Gen lacZ Produce galactosidasa. La
expresin del gen se puede activar con la
molcula IPTG

Produce
galactosidasa.
Degradacin de la
lactosa

Gen del factor

IX

El producto de la transformacin se extender sobre placas de

LB/agar que contienen ampicilina, IPTG y una molcula testigo
denominada X-Gal.

El X-Gal es un anlogo sinttico de la lactosa que es hidrolizado

por la -galactosidasa, generando un producto de color azul.

En las placas slo podrn crecer las bacterias que hayan

incorporado un plsmido (transformantes) y en todas ellas el
promotor lac estar activado por la presencia de IPTG.

Las bacterias que hayan incorporado un plsmido con el factor

IX no producirn -galactosidasa funcional por tener el gen
interrumpido, no hidrolizarn el X-Gal y darn lugar a colonias
blancas.

Las que hayan incorporado un plsmido sin el factor IX

producirn -galactosidasa que hidrolizar el X-Gal generando un
producto de color azul que colorear la colonia.

Crecimiento en
presencia de
ampicilina

Crecimiento
en presencia
de X-Gal y
IPTG

PROTOCOLO
competentes)

(Transformacin

de

plsmidos

en

bacterias

1.Marcar el n de grupo en el tubo de bacterias competentes.

2.Pipetear 20 l (25 ng) de la solucin de DNA problema marcada con
el nmero del equipo con una micropipeta de 20 l.
3.Aadir los 20 l de DNA al tubo de bacterias competentes. Mezclar
lentamente con cuidado (las bacterias competentes son muy frgiles).
Poner el tubo en hielo durante 15 minutos.
4.Marcar la placa de LB/agar + ampicilina con el nmero del grupo, el
da de la semana y la fecha.
5.Sumergir el asa de siembra en etanol y secar al aire. Pipetear 100 l
de la solucin de IPTG con una micropipeta de 100 l y depositarlos
sobre la superficie de agar. Cambiar la punta de la micropipeta. Tomar
100 l de la solucin de X-Gal y depositarlos sobre la superficie de
agar. Con el asa de siembra estril, extender las soluciones de IPTG y
X-Gal sobre toda la superficie de agar.
6.Transcurridos los 15 minutos de incubacin en hielo, poner el tubo
de bacterias competentes en el bao a 42 C durante 2 minutos.
7.Trasladar el tubo de bacterias competentes al recipiente que
contiene el hielo.

8. Pipetear 500 l de medio de cultivo lquido LB precalentado a 37 C

con una micropipeta de 500 l. Aadir los 500 l de LB al tubo de
bacterias competentes. Cerrar el tubo y mezclar invirtindolo con
cuidado. Incubar el tubo en el bao a 37 C durante 30 minutos.
9. Sumergir el asa de siembra en etanol y secar al aire. Mezclar por
inversin el cultivo contenido en el tubo de bacterias competentes
(las bacterias E. coli tienden a sedimentar en cultivos no mantenidos
en agitacin).
10.Pipetear 100 l del cultivo sobre la superficie de agar de la placa de
LB/agar + ampicilina + IPTG + X-Gal. Con el asa de siembra,
extender los 100 l sobre toda la superficie de agar.
11.Poner la placa boca abajo en la estufa incubadora a 37 C. Las
placas se dejarn incubando a 37 C durante toda la noche.
12.Comprobar que en la placa han crecido colonias de diferente color,
correspondiendo las azules a las que contienen plsmido sin inserto
y las blancas a las que contienen plsmido con inserto. Comprobar si
la extensin de la suspensin de bacterias ha sido realizada
correctamente,
habiendo
crecido
las
colonias
distribuidas
uniformemente sobre toda la superficie de la placa.

Purificacin
recombinante

del

DNA

Se inocular en medio lquido una colonia (bacterias

descendientes de una nica clula inicial) en medio lquido de
crecimiento con ampicilina.
El DNA plasmdico se replica utilizando la maquinaria de la
bacteria y el origen de replicacin del plsmido (ORI).
El nmero de copias de plsmido por bacteria puede llegar a
ser muy elevado.
A partir de estos cultivos lquidos de bacterias provenientes de
una nica bacteria portadora del plsmido recombinante, se
obtiene el DNA plasmdico utilizando el protocolo 4, que nos
permitir separarlo del DNA genmico bacteriano.

PROTOCOLO4:
minicolumna

Minipreparacin de DNA plasmdico por

1.Colocar la Solucin de Lisis en hielo.

2.Marcar un tubo de minicentrfuga con el nmero de equipo.
3.Pipetear 1,5 ml del cultivo al tubo de minicentrfuga (tres veces 500
l).
4.Centrifugar durante 1 minuto en una minicentrfuga a 13.000 rpm
5.Extraer el sobrenadante con una pipeta "Pasteur", procurando dejar
las bacterias lo ms secas posibles.
6.Poner el tubo en hielo.
7.Pipetear 400 l (4 veces 100 l) de Solucin de Lisis sobre las
bacterias sedimentadas (4 veces 100 l). Resuspender las bacterias
agitndolas con vortex durante 30 segundos hasta que la suspensin
sea totalmente homognea. 8. Incubar el tubo a temperatura
ambiente durante 3 minutos.
8.Transcurridos los 3 minutos, transferir el lisado a la minicolumna
rotulada previamente.

9. Centrifugar 1 minuto en la minicentrfuga a 13.000 rpm.

10.Pipetear 400 l (4 veces 100 l) de Solucin de Lavado sobre la
columna para lavar la resina.
11.Centrifugar 1 minuto en la minicentrfuga a 13.000 rpm.
12.Desmontar la minicolumna y colocarla sobre un tubo de
minicentrfuga nuevo.
13.Centrifugar 1 minuto en la minicentrfuga a 13.000 rpm para secar
completamente la resina.
14.Desmontar la minicolumna y colocarla sobre un nuevo tubo de
minicentrfuga previamente rotulado.
15.Eluir el DNA, aadiendo 100 l de Solucin de Elucin en la parte
central de la minicolumna. Incubar 1 minuto y centrifugar 1 minuto
a 13.000 rpm.
16.Conservar el DNA plasmdico eludo en el tubo de microcentrfuga
rotulado a -20 C hasta su uso.

ROTOCOLO 5 (Digestin del ADN recombinante)

El ADN plasmdico recombinante que hemos
purificado se digerir con el enzima AvaI.
Los fragmentos obtenidos se separarn por
electroforesis en gel de agarosa.
Se discutirn los resultados obtenidos por
cada grupo y se identificarn los plsmidos
que contienen fragmentos de las formas
normal y mutante.
Los resultados deberan ser similares a estos.

Interpretacin de geles de ADN

En ocasiones se pueden observar tres bandas distintas al cargar

un plsmido en un gel de agarosa. Estas tres bandas de distinto
tamao que correspondern a las tres formas principales con las
que migra el mismo en funcin de su grado de enrollamiento.
Son las formas circular, enrollada y superenrollada que migran con
menor a mayor velocidad, respectivamente, en una electroforesis.

Las molculas de DNA

plasmdico de una bacteria son
circulares pero, al igual que el
cromosoma bacteriano, estn
retorcidas debido a la
enzimaGIRASA, que es una
topoisomerasa de tipo II.

Segn la girasa va enrollando el

DNA,
el
plsmido
se
va
compactando ms y ms.
De forma similar a lo que ocurre con
una goma elstica, la presin
latente de la molcula cada vez ms
compactada aumenta hasta que ya
no se pueden aadir ms vueltas de
superenrollamiento.

En una clula viva, todas las molculas del plsmido (hasta 200
por clula) se mantienen en esta
formaSUPERENROLLADAgracias a un gasto continuo de
energa.

Durante la extraccin, la preparacin y la conservacin del DNA

plasmdico, es frecuente que tengan lugar algunos cortes (omellas) en
una sola hebra de las molculasSUPERENROLLADAS.
El plsmido se desenrolla inmediatamente, debido a la tensin
acumulada en los superenrollamientos, dando la formaCIRCULAR
RELAJADA.
El DNA purificado no se puede superenrollar de nuevo, puesto que no
hay topoisomerasas presentes.
Por otra parte, si se produce el corte
en las dos hebras
dealgunasmolculas de plsmido, se
convertirn en molculasLINEALES
DE LONGITUD COMPLETA.
Las tres formas, superenrollada,
relajada y lineal, tienen la misma
longitud o n de pb, y lamisma
masa molecular, pero distinta
conformacin y, as, distinto volumen
efectivo, distinto tamao
tridimensional.

Las tres formas de un plsmido no cortado con

enzimas de restriccin, todas de la misma
longitud (n de pb) y misma masa molecular, no
se comportan del mismo modo durante la
electroforesis. Las molculas SUPERENROLLADAS
son ms compactas, su volumen es menor, se
mueven con ms facilidad a travs del gel, y las
encontramos ms lejos del punto de origen, el
pocillo.
Las molculas CIRCULARES RELAJADAS y las molculas LINEALES
DE LONGITUD COMPLETA avanzan ms lentamente que las
superenrolladas.
Habitualmente, las molculas lineales avanzan un poco ms rpido
que las circulares relajadas pero, dependiendo del plsmido
concreto y de las condiciones experimentales (por ejemplo, si se ha
aadido o no bromuro de etidio al gel antes de la electroforesis), la
forma lineal puede avanzar igual o menos que la relajada.

Los patrones de ADN en los geles de

agarosa son molculas lineales, y por
lo tanto no se pueden comparar los
ADN no cortados con enzimas de
restriccin con dichos patrones, pues a
pesar de tener el mismo tamao
corren distancias distintas

Patrones de ADN

Digestin del plsmido con el enzima de

restriccin AvaI
1.Marcar un tubo de minicentrfuga con el nmero de cada
grupo.
2.Pipetear 20 l del plsmido en el tubo.
3.Aadir 20 l del enzima AvaI.
4.Poner el tubo en un bao a 37 C durante 30 minutos.
5.Mientras se realiza esta digestin preparar los geles de
agarosa segn Protocolo 2.
6.Aadir 20 l de tampn de muestras.