Transcriptional and metabolic response of

recombinant Escherichia coli to spatial dissolved

oxygen tension gradients simulated in a scale-down
system

Alvaro R. Lara,1 Lidia Leal,2

Noem Flores,2 Guillermo
Gosset,2 Francisco Bolvar,2
Octavio T. Ramrez

Introduccin
Ambiente
oscilante
Afecta
Diferencia
entre gran
escala y nivel
laboratorio

Metabolismo
Comportamiento
fisiolgico

Escalamient
o hacia
abajo
Problemas de mezclado
Gradientes espaciales

Efecto pH
TOD
Gradiente

Gradientes de TOD

Consumo especifico oxigeno 5-20

mmol/g-h

Tiempo con sumo oxigeno es

mejor
Tiempo de circulacin es de la
misma magnitud (3-60 s)
Se adapta a las
limitaciones de TOD al
ser anaerobio
facultativo

Niveles de glucosa
minimos

A costa de
Biomasa
Producto

Sandoval
Basurto
determino los
efectos en la
produccin de
pre-insulina

Recirculadas entre aerobio y

anaerobio

0-180 s

13.3 s perjudicial
para protena
heterloga

Expresin de genes
como respuesta al
estres

Repercusiones en
rendimiento del
proceso
Difcil de
analizar a nivel
proteico

Escalamiento
descendente
Rendimiento
Productividad
Acumulacin de
subproductos
Poco
Efecto de gradientes a
nivel molecular
Oscilaciones
TOD

Efecto de patrn de
glicosilacin de un anticuerpo
monoclonal
Distrubucion del peso
molecular del alginato

 Niveles relativos de trascripcin

21 genes de E. coli recombinante
Sujeto a gradientes de TOD
citocromo
s

Quorumsignal
ing sintetasa

Genes que
responden a
disponibilidad
de O2

Reguladores
metabolismo

Productos heterlogos

Superoxido
dismutasa

MATERIALES Y METODOS

Cepa, medio cultivo e

inoculo
Escherichia coli W3110 transformada
con plasmido pV21
green
fluorescence
plasmido pBCSK+
protein (GFP)
Medio glucosa mineral
espectonomici
Suplemento de
na 100
magnesio
sulfato,
elementos traza,
glucosa, tiamina,
y
espectonomicina

INOCULO

mg/L

1mL cultivo conservado

criogenicamente
Crecimiento en matraz hasta
densidad 600nm

NdeI y XhoI
Gen
hetrologo
Bajo el
control de
promotor del
gen LagZ

Escalado descendente
pH 7.1

Bombe
o
clulas

Aerobio

66% clulas
En
condiciones
pobres de

TOD 10%
0.4L

Anaerobio

TOD 0%
0.8L

Tiempo de
circulacin 50
s

Enfoque experimental
Inicialment
e los dos
tanques
TOD 10%

Toma
muestra
Aerobio
Y
anaerobi
o

OD600 de
1.0 se
alcanzo

Duplicacion
celular
completa

2 cultivos

Se
mantuviero
n
condicione
s por 2 hrs
Muestras
enfriadas con
hielo + RNA
RT-PCR later1 y
centrifugadas a
4C

Toma
muestr
a

Anaerobi
o
TOD 0%

Procedimiento analtico
Determinacin
HPLC
Concentracin
glucosa
Concentracin
cidos organicos

Biomasa medido por

espectofotometro

Crecimiento celular
medido por
densidad optica
(600nm)

Intensidad defluorecencia
por espectofotometro de
luminicencia
480nm excitacin
507nm emisin

Intensidad
relacionada con

Extraccin ARN, sintesis cADN y RTPCR

Integridad ARN
Extraccin
medido en geles de
RNA
agarosa
Fenol
caliente eq.
con agua y
Concentraci
precipitado
n medido por
con
densimetria
C2H3NaO2
260/280nm
3M y etanol
Tratado con
kit DNAsa
Gfp (5 -TGGCGAAAACAATGAACACC y 5
-ATGGATCCCTCTTTCTGGCA)
luxS (5 -CGTGGCCAACCCTAGTCACT y 5 GGGCATGGCACTCTTGAAAA)
RT-PCR primer 2M

cADN
sintetizado
usando
RevertAid
Cebadores
reportados
por Flores
2005