PURIFICACIN DE PROTENAS

Cunta protena
tengo?

Mtodos
Espectrofotomtric
os

Absorbanci Colorimetra
a de luz
UV

Biure Lowr Bradfor Fluorescamina

t y d
 MEDIDA DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA

S + E P

Por desaparicin de sustrato

(S)

Por aparicin del producto (P)

Siempre debe acordarse que:

En el extracto crudo y despus de cada etapa en

una purificacin, se debe medir la cantidad de
protena y la actividad enzimtica para poder
evaluar la purificacin realizada.
Etapa de Proten Actividad Rendi- Purifica
la a total Totalx10-3 Miento -
purificaci (mg) Cin
(U) (%)
n (veces)

Extracto 133.55 136.62 100.0 1.0

crudo
Se proceder a aislar la enzima de
las otras molculas del medio,
utilizando diferentes mtodos:

- precipitacin fraccionada
- cromatografa
 Precipitacin fraccionada

Precipitacin por sales (sales empleadas)

Solventes orgnicos (etanol absoluto)
Punto isoelctrico
Por calor
Fuerza inica
pH
 Cromatograf
a

10
Cromatografa

Es un proceso en el cual se
realiza la separacin de
molculas basada en diferencias
de su estructura y/o de su
composicin.
Cromatografa

Las molculas en la mezcla

tendrn diferentes
interacciones con el soporte
estacionario y as las mol-culas
que se comporten de manera
semejante ante el soporte, se
separa-rn del resto.
Cromatografa lquida

Exclusin molecular o filtracin

en gel
Intercambio inico
Afinidad
Interaccin hidrofbica
Cromatografa lquida

Este es el mtodo
mediante el cual las
protenas son separadas
de acuerdo a sus
propiedades fsicas
tamao, forma, afinidad
por el ligando, carga, etc.
 Cromatografa lquida

Se lleva a cabo en
columnas cilndricas que
acomodan en su interior a
la matriz la cual retarda
el flujo de algunas
molculas mientras deja
pasar a las dems.
Cromatografa de exclusin
molecular
(Filtracin en gel)

Separa en
funcin al
tamao.
 CROMATOGRAFIA DE
INTERCAMBIO IONICO
Cromatografa de intercambio
inico
Separa molculas con
diferentes cargas netas.

L matri en la columna
a z
el paso retarda
de las protenas
que tienen carga opuesta.
La cromatografa de intercambio inico se
fundamenta en las propiedades cido-
base de las protenas:

Una protena, a pH menor de su pI

(punto isoelctrico), tendr carga
positiva y a pH mayor de su pI
presentar carga negativa. Por lo
que, en el primer caso, se unir a
una matriz con carga negativa y en
el segundo a una matriz con carga
positiva.
Cromatografa de intercambio
inico

Ejemplos de
matrices:
DEAE (dietilaminoeti
l)
celulosa
CM celulosa (carboximeti
l)
Cromatografa de intercambio aninico:
Cromatografa de intercambio aninico:

P- Cl-
Cl- P-
P-
+ Cl-
+ P- Cl-
Cl -
P - P-
Cl-
Cromatografa de intercambio
catinico:
Cromatografa de intercambio catinico:

P+ Na+
Na+ P+

- Na+ P +
- P+
Na+

Na+ P + Na+
P +
Una vez unida la protena a las
matrices, stas se pueden eluir de
dos formas distintas:

1) variando el pH del medio hasta

alcanzar el pI

2) mediante la adicin de iones

aadiendo el contrain
correspondiente (Na+ en el caso de
intercambio catinico).
Cromatografa de interaccin
hidroffica
La cromatografa de
interaccin hidrofbica
(HIC) es una de las
principales tcnicas
utilizadas para la Grupo octilo de Octyl
separacin y purificacin Sepharose CL-4B
de protenas en
procesos En HIC, las protenas se unen
biotecnolgicos.reversiblemente a ligandos
hidrofbicos que se encuentran
inmovilizados en el soporte
cromatogrfico, debido a la
presencia de una elevada
Grupo fenilo de concentracin de sal. La elucin
Phenyl se logra disminuyendo la fuerza
Sepharose CL- inica en la fase mvil, formando
Cromatografa de afinidad
Cromatografa de afinidad
La finalidad de la cromatografa de
afinidad es separar todas las
molculas con una especificidad
determinada del resto de molculas
de una mezcla como por
ejemplo, el suero sanguneo. Los
anticuerpos en una muestra de
suero especficos para un
determinante antignico dado,
pueden ser aislados utilizando
cromatografa de afinidad.
Cromatografa
de
inmunoafinidad
 AFINIDAD POR IONES
METLICOS

GRUPOS
IMIDIAZOL MATRIZ
(HIS)
 Comprobacin de la pureza
de la enzima
Electroforesis PAGE-SDS
Isoelectroenfoque + PAGE-SDS (electroforesis
bidimensional)
Electroforesis
Electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS (PAGE):

La cadena se despliega y se pierden las estructuras

cuaternaria, secundaria y terciaria.

La cadena se despliega y se rodea de muchas molculas

de SDS (dodecil sulfato de sodio).
Electroforesis en gel de
poliacrilamida-SDS (PAGE):
Las numerosas cargas negativas que transportan las
muchas molculas de SDS unidas a la protena hacen que
la carga que sta transporta sea insignificante.

La cadena polipeptdica se transforma entonces en un

objeto alargado cuya carga y longitud son proporcionales
a la longitud de la cadena.
Cromatografa
Bidimensional
Presentacin de los
resultados
 Presentacin de los resultados
Etapa de Proten Actividad Rendi- Purifica
la a total Totalx10-3 Miento -
purificaci (mg) (%) Cin
n (U)
(veces)
Extracto 133.55 136.62 100.0 1.0
crudo
Precipitaci 18.98 37.62 27.54 1.9
n por
sales
Intercambi 9.72 37.55 27.48 3.6
o inico
afinidad 5.50 35.50 23.70 6.0

Unidad(U), la cantidad de enzima que libera 1mol de p-nitroanilina