Digital PCR for the

molecular detection of
fetal
chromosomal aneuploidy
DIAGNOSTICO PRENATAL
Trisoma 21

Mtodos convencionales de diagnstico

Muestreo de materiales fetales (procesos invasivos): Amniocentesis
Cribado por ultrasonografa
Marcadores bioqumicos.

Mtodos genticos no invasivos

Aqu se describir un enfoque usando PCR digital
para la deteccin no invasiva de la trisoma fetal
21

Demostracin del uso de la PCR digital para determinar el

desequilibrio allico de una SNP en PLAC4 mRNA (RNA
SNP)
Mtodo de las dosis relativas digital en el cromosoma
(RCD)
Se aplico la prueba de razn de probabilidad secuencial
para interpretar los datos de la PCR digital.
TRISONOMIA FETAL 21 (T21)
Importante para el diagnostico prenatal
Descubrimiento de ADN fetal libre de clulas en el plasma materno (DPNI)
Trastorno ligados al sexo
Trastornos de un solo gen
Uso para aneuploidas cromosmicas : (reto)

Coexisten en el plasma materno con alto contenido

de plasma materno (interferencias)

cidos Nucleicos

Circulan en el plasma como formas libre de clulas

fetales
Recientemente se han hecho progresos significativos. Un enfoque
se enfoca en la deteccin de especies de cidos nucleicos que son
fetales especficas, incluyendo fragmentos de ADN con un patrn
de metilacin del ADN especfico de la placenta y molculas de
ARN expresadas por la placenta Debido a que los cidos nucleicos
fetales circulantes se derivan principalmente de la placenta, el
problema de la interferencia materna de fondo se puede superar
dirigiendo esas molculas en el plasma materno.
LA PCR DIGITAL
Mltiples anlisis de PCR sobre cidos nucleicos extremadamente
diluidos.
Tcnica propuesta para permitir la deteccin de una variedad de
fenmenos genticos.

Principios de la PCR Digital

Dilucin de los cidos nucleicos
Una muestra se reparte para que las molculas individuales de cido
nucleico dentro de la muestra son localizadas y concentradas dentro
de muchas regiones distintas.
 El repartir de la muestra permite estimar el nmero de molculas diferentes
por asumiendo que la poblacin de la molcula sigue la Distribucin de
Poisson. Como resultado, cada parte contendr "0" o "1" de las molculas o
una reaccin positiva o negativa, respectivamente.
Despus de la amplificacin de la polimerizacin en cadena, los cidos
nucleicos pueden cuantificarse contando las regiones que contienen el
producto final PCR, reacciones positivas. En PCR convencional, la cantidad de
ciclos de amplificacin de PCR es proporcional al nmero de copia inicial.
dPCR, sin embargo, no es dependiente en el nmero de ciclos de
amplificacin para determinar la cantidad de muestra inicial, eliminando la
dependencia exponencial de los datos incierto para cuantificar cidos
nucleicos Diana y por lo tanto proporciona la cuantificacin absoluta.
Digital RNA SNP
Principis de RNA SNP digital

Versi n digital para la detecci n de T21 mediante la determinaci n de un

desequilibri en la prprci n de alels plim rfics de un SNP A/G -

El bjetiv es analizar si las cantidades de alels sn iguales n

El la T21 una cpia adicinal de alels SNP dara una relaci n de

2:1
 MUESTRA cDNA

Se disea una PCR en tiempo Real

para amplificar ARNm (plasma
materno-fetal)de PLAC 4

Cuando se determino que por lo

menos 37% de los pocillos era
negativo se hizo el anlisis de RNA
SNP digital usando la misma muestra
diluida para 384 pocillos

Para una caso euploide se espera

igual n de pocillos para A y G,
En T21 el numero de pocillo que
contiene solo alelo debe ser mayor
que el que contiene el otro
ALELO
SOBREEXPRESADO
 El alelo sobrexpresado se calculo su proporcin entre todos los pozos..

Se aplico la prueba SPRT ( razn probabilidad secuencial) para determinar si Pr

indicaba un grado de desequilibrio allico lo que se espera para T21.

La hiptesis nula es que no hay desequilibrio allico o cromosmico (es decir,

T21 no se detecta). La hiptesis alternativa es que existe desequilibrio allico
o cromosmico (T21)

El SPRT se puede realizar con un par de curvas

SPRT que se construyen para definir los lmites
probabilsticos para aceptar o rechazar la
hiptesis nula.
El SPRT se puede realizar con un par de curvas
SPRT que se construyen para definir los lmites
probabilsticos para aceptar o rechazar la
hiptesis nula.
Las muestras con puntos de datos que estn por
encima de la curva superior se clasifican como
trismicas . Las muestras con puntos de datos
que estn por debajo de la curva inferior se
clasifican como euploides.
DIGITAL RCD
DIGITAL RCD

Digital Relative Chromosome Dosage ( Dosis Cromosmica

Relativa)

Se La cuantificacin de una
secuencia especifica Esta proporcin se
determina la proporcin de identifica como la dosis
ADN que corresponde a un cromosmica fetal.
cromosoma en particular.
 DIGITAL RCD
Proporcin
Embarazo de un
relativa de
feto con trisoma
molculas de
21, la cantidad
ADN en un
proporcional de
cromosoma de
molculas de ADN
referencia (Chr 1)
en plasma que se
es constante en
originan en el
embarazos
cromosoma 21 se
euploides o
incrementa.
normales.

Relacin 2:2 Relacin 3:2

Metodologa

Cuantificacin
de muestra por
Nanodrop.

Dilucin 1 37 %
secuencia
target por
pocillo Anlisis por RT-PCR con
(Chr 21 o Chr una secuencia presente
1) en ambos cromosomas.
Metodologa
Muestra diluida analizada

En un embarazo normal el
n de pocillos positivos
para ambos cromosomas
es igual.
En un embarazo T21 el n
de pocillos positivos para el
cromosoma 21 es mayor
que para el cromosoma 1
de referencia.
Metodologa

Anlisis estadstico por SPRT

La proporcin (Pr) es calculada

dividiendo el numero de pocillos
positivos para el Cr 21 entre el
numero total de pocillos
positivos para ambos
cromosomas.