CITOQUMICA LEUCOCITARIA

tcnicas utilizadas para identificar de forma diagnostica

enzimas tiles
sustancias en el citoplasma

usos
resultados

interpretarlos
Tipificar como mieloides las clulas blsticas
Identificar los componentes granulocticos y monocticos
Identificar las estirpes , en los trastornos mieloides
colorantes de Romanowsky clonales (p. ej., los basfilos y los mastocitos).
tcnicas inmunolgicas Detectar las anomalas citoplasmticas y el dficit
enzimtico
 FUNDAMENTO

La demostracin de esta enzima,localizada en los grnulos azurfilos

se basa en su accin oxidante sobre su sustrato, la bencidina, en
presencia de H2O2.
La positividad de la reaccin se pone de manifiesto por la aparicin de
un precipitado pardo-oscuro en el citoplasma celular.

grnulos primarios y secundarios de los

neutrfilos sensible al cianuro

grnulos azurfilos de los monocitos

grnulos de los eosinfilos

resistente al cianuro
 Mtodo con la 3,3-diaminobencidina
Reactivos
Fijador: Acetona formalina tamponada
(AFT).
Sustrato:3,3-DAB
Tampn:Tampn fosfato de Sorensen a pH
7,3.
Perxido de hidrgeno (H2O2, 30% p/v).
Contratincin: Hematoxilina acuosa.
Mtodo
Fijar los frotis secados al aire durante
30 s en AFT fra.
Aclarar minuciosamente con agua del
grifo a baja presin y secar al aire.
Incubar durante 10 min en la solucin
operativa delsustrato. Mezclar
completamente 30 mg de DAB en 60
ml de tampn, aadir 120 l H2O2 y
mezclar bien.
Contrateir con hematoxilina durante
1-5 min, aclararminuciosamente bajo un
chorro de agua del grifo y secaral aire.
 INTERPRETACIN

+ = Toda la serie neutrfilo (todos sus estadios)

+/- = Serie monoctica (difuso)
- = Linfocitos y eritrocitos
- = Basfilos maduros de individuos normales
- = Megacariocitos y plaquetas (demostrable por citoq.
ultraestructural)

Se considera positivo a Mieloperoxidasa para neoplasias

hematolgicas:
Debe haber de 3 % a ms de clulas neoplsicas
(blastos) positivos a mieloperoxidasa, as sea una
positividad dbil.
Las neoplasias positivas a Mieloperoxidasa se
denominan Neoplasias mieloides, pero con poca
certeza se puede considerar las negativas.
La tincin con mieloperoxidasa muestra bastones de
Auer y tincin granular citoplasmtica.
LMA M1.PEROXIDASA POSITIVOS
 En la mayora de casos de M1,M2,M3 el 85% o ms blastos o
promielocitos son + a la peroxidasa.
Los cuerpos de AUER tambien son +.
En M4 y M5 los monocitos precursores son dbilmente positivos a
negativos.
En M6 los precursores eritroides son -
En M7 slo es demostrable por microsp. Electrnica.

En SMD ,LMA, leucocitosis por infeccin: los neutrfilos pueden

mostrar
una disminucin de la actividad peroxidasa.
En LMC tambin hay disminucin de la actividad
Diferenciacin de celularidad
blstica mieloide(+) y linfoide(-)
 FUNDAMENTO

Se basa en solubilidad del colorante empleado en los lpidos.

Tie grasa neutras,fosfolpidos y esteroles.
Tambin colorea componentes celulares no lipdicos tales como
grnulos azurfilos,especficos y cuerpos de AUER

colorante lipfilo que se une de forma irreversible a un

componente granular indefinido en los granulocitos, en los
eosinfilos y en algunos monocitos.
 REACTIVOS UTILIDAD

Fijador: Solucin de formaldehido al 40%. Distinguir la LMA de

Colorante: NSB 0,3 g en 100 ml de etanol LLA
absoluto.
Tampn fenol: Disolver 16 g de fenol
cristalino en 30 ml de etanol absoluto.
Aadirlo a 100 ml de agua destilada en la que
se hayan disuelto 0,3 g de Na2HPO4.12H2O2.
Solucin de tincin operativa: Aadir 40 ml
La sudanofilia es equivalente a la
de tampn a 60 ml de solucin NSB. reaccin de la MPO
Contratincin:Colorante de May-
Grunwald-Giemsa o de Leishman.
 MTODO

Fijar los frotis secados al aire con vapor de formalina de la siguiente forma. Colocar un
pequeo cuadrado de papel filtro en el fondo de una cubeta de Coplin. Aadir 2 gotas de
formalina al 40%, poner la tapa y dejarla durante 15 min. Colocar las extensiones en la
cubeta de Coplin y volver a poner la tapa. A los 5-10 min, retirar las extensiones y dejarlas
de lado durante 15 min para que se ventilen.
Sumergir las extensiones en la solucin de tincin operativa durante 1 h en una cubeta de
Coplin con la tapa puesta.
Transferir las extensiones a una gradilla de tincin y anegarla inmediatamente con alcohol
al 70%. Despus de 30 s, volcarla para tirar el alcohol al 70% y anegarla de nuevo durante
30 s. Repetir tres veces en total.
Aclarar con agua del grifo a baja presin y secar al aire.
Contra teir sin mas fijacin con el colorante de Leishman o con May-Grunwald-Giemsa.
La actividad fosfatasa alcalina se encuentra
fundamentalmente en los neutrfilos maduros, con algo de
actividad en los metamielocitos.

Los dems leucocitos suelen ser negativos

Los macrfagos de la medula sea son positivos.

Los mtodos inciales para demostrar la fosfatasa alcalina se basaban en la

utilizacin de glicerofosfato o de otros fosfomonoesteres.

Estos mtodos utilizan naftoles sustituidos como sustrato y es el naftol

liberado, ms que el fosfato, el que se utiliza para combinarse con el
azocolorante y dar el producto de reaccin final.
Definicin
La FA es una fosfomonoesterasa que es activa
francamente a pH alcalino y acta sobre grupos esteres
fosforados liberando el ion fosfato.
FAL es una enzima que se encuentra en los grnulos
secundarios de los neutrfilos.
 Inicialmente se pens que la FA estaba localizada en
grnulos especficos (secundarios), pero se demostr que
esta asociada con un componente membranoso del
citoplasma identificado como una estructura tubular de
forma irregular distinta de los grnulos 1 o 2 y de otras
organelas citoplasmticas.
Fundamento
Se basa en la hidrlisis del sustrato naftol AS-BI fosfato en
presencia de un pH alcalino, de los cuales se liberan unos
productos intermedios que combinados con una tincin
como LB Fast red-violet o BB Fast blue (sal diazoica) dan
un precipitado coloreado.
 Alfa naftil
fosfato
pH alcalino
FAL

Naftilo Fosfato

Compuesto diazotado
 Fijador: Metanol formalina al 4%. Anadir 10 ml
de formalina al 40% a 90 ml de metanol.
REACTIVOS

Sustrato: Naftol AS fosfato (Sigma N-5625).

Tampn: Tampn Tris 0,2 mol/l a pH 9,0.

Solucin madre de depsito: Disolver 30 mg de

naftol AS fosfato en 0,5 ml de N, N-
dimetilformamida . Aadir 100 ml de tampn
Tris, 0,2 mol/l, a pH 9,1.

Azocolorante de acoplamiento: Sal de azul

rpido BB .

Contratincin: Rojo neutro en solucin acuosa al

0,02%.
 Mtodo
Preparar una solucin de
sustrato operativa .
Fijar las extensiones Aadir 24 mg de azul
sanguneas durante Aclarar con agua del rpido BB y mezclar
30 s en metanol grifo y secar al aire. minuciosamente hasta
formalina al 4% frio. que se disuelva. Incubar
las extensiones durante
15 min.

Contrateir Aclarar
Consideraciones tcnicas
La N, N-dimetilformamida puede disolver algunos tipos de
plstico

Hay que realizar las extensiones sanguneas al poco tiempo de

la extraccin de la sangre,

La extensin sangunea, una vez realizada, se debe teir antes

de las 6 h.

Las extensiones de control con un ndice previsiblemente alto,

deben hacerse tambin, si es posible, a partir de muestras de
sangre fresca.
El intervalo de normalidad para los adultos sanos debe
establecerse en cada laboratorio individual utilizando una
tcnica de tincin estndar y unos criterios coherentes de
valoracin.
Usos
til para diferenciar la leucemia mieloide crnica de una
reaccin leucemoide, presente en infecciones graves.
Resultados e interpretacin

El producto de reaccin es azul y granular.

La intensidad del producto de reaccin en los

neutrfilos vara desde negativo a fuertemente
positivo, con grnulos toscos rellenando el citoplasma y
superponindose al ncleo .

El ndice general se obtiene sumando la intensidad

de la tincin de 100 neutrfilos consecutivos,
valorando cada neutrfilo en una escala de 1-4 de la
siguiente forma:
 Resultados e interpretacin
0: Negativo, sin grnulos.
1: Grnulos ocasionales
dispersos por el citoplasma.
2: Cantidad moderada de
grnulos.
3: Grnulos numerosos.
4: Fuerte positividad con
numerosos grnulos toscos
atestando el citoplasma y
superponindose
frecuentemente con el ncleo.

Fosfatasa alcalina granulocitaria. Se muestran intensidades

de reaccin fuertemente positiva (4+) y moderadamente
positiva (3+ y 2+).
Fosfatasa alcalina
leucocitaria con reactividad
de 0 a 4+
(sangre perifrica, x 1000)
 SCORE
De acuerdo con la intensidad del color, en cada uno de los
neutrfilos examinado, hay 5 grados de actividad de la
enzima que es apreciado por una puntuacin de 0-4 .
Se examinan 100 neutrfilos (en presencia de
neutropenia, el 10% de neutrfilos no puede incluirse en los
centenares) y se asigna a cada uno una puntuacin. Cada
puntuacin se multiplica por el nmero de neutrfilos
con el mismo grado de actividad. Las puntuaciones se
aaden y el resultado final, con 5 conteos diferentes (0-4)
y la revisin de 100 neutrfilos, puede variar entre 0 y
400. En sujetos sanos, los intervalos de referencia de los
leucocitos de la fosfatasa alcalina se incluyen entre 30 y
100 . Es debido a la naturaleza subjetiva de los resultados
de la evaluacin, cada laboratorio debe establecer sus
propios valores de referencia. Por debajo de 20 o por
encima de 150 valores se consideran patolgicos.
Puntuacin de la Recuento de Puntaje total para un
actividad neutrfilos determinado
0 22 0
1 34 34
2 32 64
3 11 33
4 1 4
100 Puntuacin final = 135
 Un score normal en adultos vara entre 40-120.
En una leucemia mieloide crnica el score disminuye (0-15).
Score disminuido se puede dar en: hemoglubinuria nocturna
paroxstica, algunos sndromes mielodisplsicos,
hipofosfatasia nocturna y sepsis neonatal
Score aumentado (>180) se puede dar en: reaccin
leucemoide, policitemia vera, metaplasia mieloide,
mielofibrosis primaria, trombocitosis esencial,
administracin de glucocorticoides y en el tercer trimestre
de embarazo.

Desde la introduccin de los mtodos de la biologa

molecular, la fosfatasa alcalina leucocitaria ha perdido su
importancia. El diagnstico de la leucemia mieloide crnica es
ahora compatible con un examen ms especfico: deteccin de
la transcripcin de secuencias del gen bcr-abl por RT-PCR
(reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa
reversa).
 La fosfatasa acida
La intensidad de la tincin de los
citoqumicamente demostrable es
distintos tipos celulares vara
ubicua en las clulas
segn el mtodo utilizado.
hemopoyticas.

Estas enfermedades se
Su principal utilizacin consiste
identifican y diagnostican de
en el diagnostico de la LLA de los
forma ms fiable por
linfocitos T y de la leucemia de
inmunofenotipado cuando se
clulas peludas o tricoleucemia.
dispone de esta tcnica.

Para demostrar la actividad de la fosfatasa acida

resistente al tartrato se puede preferir la utilizacin
de Fast Garnet GBC como reactivo de acoplamiento.
Definicin
Es una enzima hidroltica perteneciente al grupo
de las fosfomonoesterasas, que acta sobre los
steres del cido fosfrico; su pH ptimo de
actuacin oscila entre 4,7 y 5,5. Se trata de una
enzima de ubicacin lisosmica.
Fundamento

La demostracin citoqumica se basa en la

hidrlisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato,
liberndose unos productos intermedios que al
combinarse con una tincion como BC fast garnet
(sal diazoica) dan un precipitado de color rojo
anaranjado en el citoplasma.
 Cuando se agrega cido tartrico, todas las
isoenzimas, excepto la 5, se inhiben. La
isoenzima 5 es resistente al tartrato. Para
describir este fenmeno se utiliza el trmino
tincin de TRAP (cido fosfatasa resistente-
tartrato).
La reaccin de fosfatasa acida en la mayora
de las clulas sanguneas se inhibe por el
tartrato, no sucede lo mismo con las clulas
vellosas.
 Fijador: Metanol, 10 ml; acetona, 60 ml; agua,
30 ml, y cido ctrico, 0,63 g. Ajustar el pH a
5,4 con NaOH, 1 mol/l antes de utilizarlo.
REACTIVOS

Tampn a pH 5,0: Acetato sdico trihidrato,

19,5 g; barbiturato sdico, 29,5 g; agua hasta
1 l.

Solucin de sustrato: 25 mg de naftol AS-BI

fosfato disuelto en 2,5 ml de N, N-
dimetilformamida.

Nitrito sdico: Solucin acuosa de NaNO2 al

4%.

Reactivo de acoplamiento:
 Pararosanilina de depsito. Disolver
1 g de pararosanilina en 25 ml de
HCl caliente, 2 mol/l.
REACTIVOS

Solucin de nitrito sdico al 4%.

Disolver 200 mg de nitrito sdico en
5 ml de agua destilada. Es estable
durante 1 semana a 4-10 C.

Pararosanilina hexazotada. Mezclar

volmenes iguales de pararosanilina
y nitrito sdico al 4% durante 2 min
antes de su utilizacin.
 Contratincin: Verde metilo acuoso o hematoxilina
acuosa al 1%.
REACTIVOS

cido tartrico L(+)

Solucin operativa A. Mezclar 92,5 ml de tampn con 2,5 ml de

la solucin de sustrato. Anadir 32,5 ml de agua destilada y a
continuacin 4 ml de pararosanilina hexazotada.

Mezclarlas bien y ajustar el pH a 5,0 utilizando

NaOH, 1 mol/l.

Solucin operativa B. Anadir 375 mg de cido

tartrico L (+) cristalino a 50 ml de solucin
operativa A; la concentracin final ser de 50
mmol/l.
 Mtodo
Secar las extensiones al aire durante varias horas (a ser
posible, 24 h).

Fijarlas durante 10 min en metanol/acetona/cido ctrico,

aclarar con agua del grifo y secar al aire.

Incubar durante 1 h a 37 C en las soluciones operativas.

Aclarar con agua del grifo y secar al aire.

Contrateir en verde metilo acuoso

Aclarar con agua del grifo y montarlas, as humedecidas, en
gel de glicerina caliente.
Usos
Confirmacin del diagnstico de leucemia de
clulas pilosas (linfocitos B).
Resultados e interpretacin
El producto de la reaccin es rojo con una mezcla de positividad
granular y difusa.
En los linfocitos T, la fosfatasa acida es una caracterstica
diferenciadora precoz. Casi todas las leucemias de la estirpe T, tanto
agudas como crnicas, muestran una fuerte actividad de la misma.
En todas las LLA de la estirpe T, la actividad suele estar muy
localizada (polar). Los granulocitos son fuertemente positivos.
Los monocitos, los eosinfilos y las plaquetas presentan una positividad
variable. En la medula sea, los macrfagos, las clulas plasmticas y los
megacariocitos son fuertemente positivos.
En la leucemia de clulas peludas la mayora de las clulas leucmicas
reaccionan positivamente tanto en presencia como en ausencia del cido
tartrico.
Cuando se dispone de inmunofenotipado, la reaccin de la fosfatasa
acida no modificada es redundante.
Tambin es redundante si se dispone de un panel completo de
anticuerpos monoclonales adecuados.
Resultados e interpretacin
FOSFATASA CIDA TARTRATO-RESISTENTE

Es un examen efectuado en las clulas sanguneas

o mdula sea (biopsia) que se lleva a cabo para
corroborar un diagnstico de leucemia de clulas
pilosas. Asmismo, se puede realizar en el plasma
sanguneo, en cuyo caso, se est buscando signos
de descomposicin sea, por ejemplo para medir la
destruccin del hueso causada por cncer.
 Es una isoenzima de la fosfatasa cida que se encuentra principalmente en
osteocitos y algunas clulas sanguneas. Las isoenzimas son diferentes formas de
una enzima con estructuras fsicas diferentes, pero que catalizan (aceleran)
reacciones bioqumicas similares y con frecuencia difieren en concentracin en los
distintos tejidos.
La leucemia de clulas pilosas es un tipo de cncer de la sangre en el cual se ha
encontrado que los niveles de la fosfatasa cida tartrato-resistente son muy
altos. Una tincin para este tipo de fosfatasa en las clulas de la leucemia en la
sangre o en la mdula sea puede ayudar a corroborar un diagnstico de leucemia
de clulas pilosas. Si el examen es negativo, es improbable el diagnstico de este
tipo de leucemia.
Es liberada durante la actividad de los osteoclastos, un tipo de clula que
descompone el hueso; por tal razn, cualquier condicin en la cual el hueso se
descomponga ms rpidamente de lo usual puede llevar a que se presenten niveles
excesivos de esta isoenzima en la sangre. En este caso, la TRAP no est contenida
dentro de las clulas sanguneas, sino que est libre en el plasma, la parte lquida
de la sangre.
La actividad de los cnceres que invaden el hueso, como el mieloma mltiple y el
cncer de prstata, mama y pulmones que han hecho metstasis al hueso, se puede
rastrear con la medicin de los niveles de esta isoenzima en el plasma. Este
examen an no tiene un uso muy amplio para estas condiciones, pero
probablemente se va a utilizar mucho ms en el futuro si se comprueba su utilidad
a travs de la investigacin.
 Valores normales
Debe haber menos de 5 ng/ml de fosfatasa
cida ante la presencia de tartrato.
Nota: ng/ml = nanogramo por mililitro.
Resultados
Tricoleucemia: Tincin fosfatasa cida
(+) tartrato resistente
 oxida de forma
El cido perydico grupos glicol 1-2
especfica

producir

dialdehdos estables

producto

de reaccin rojo al exponerlos

al reactivo de Schiff
Reacciones positivas:
Glucgeno
Monosacridos
Polisacridos
Glucoprotenas
Mucoprotenas
Azucares fosforilados

En clulas hemopoyticas, la principal causa de

reacciones positivas es el glucgeno.
Reactivos
Fijador: Metanol.
cido perydico al 1%
Reactivo de Schiff
El reactivo es estable durante 6 meses a
temperatura ambiente, almacenado en la oscuridad.

Contratincin. Hematoxilina acuosa.

Resultados
Las clulas PAS+ son:
Neutrfilos
Megacariocitos y plaquetas
Linfoblastos
Eritroblastos
Linfocitos (10-40%)
Es una tincin muy til para el diagnstico de:
LLA (L1-L2)
LMA M6
PAS para Dx de LLA
LMA6 (eritroide) MO PAS: todos los precursores
eritroide contienen glucgeno, nunca los normales.
Cuando se utiliza con frotis de sangre o
mdula sea, esta prueba puede ser til en el
reconocimiento de algunos casos de
eritroleucemia y leucemia linfoblstica aguda.
 NAFTOL AS-D
CLOROACETATO ESTERASA
Reactivos
Fijador : Acetona formalina tamponada
Tampn: Tampn fosfato

Solucin de sustrato de Naftol AS-D cloroacetato: Disolver 0,1 g de naftol AS-D

cloroacetato en 40 ml de N,N-dimetilformamida

Solucin de sustrato operativo: Anadir 2 ml de la solucin de depsito de naftol

AS-D cloroacetato a 38 ml de tampn fosfato. Anadir 0,4 ml de nueva fucsina
hexazotada.

Reactivo de acoplamiento:
Nueva fucsina hexazotada.
Solucin de nitrito sdico.
Inmediatamente antes de su utilizacin, aadir 0,2 ml de la nueva fucsina hexazotada a
0,4 ml de nitrito sdico, mezclar bien y dejar reposar durante 1 min antes de aadir a la
solucin de sustrato.

Contratincin: Hematoxilina acuosa.

Mtodo
Fijar los frotis secados al aire
durante 30 s en acetona
formalina tamponada fra.
Aclarar con agua del grifo a
baja presin y secar al aire.
Sumergir las extensiones en la
solucin de sustrato operativa
en una cubeta de Coplin
durante 5-10 min.
Aclarar con agua del grifo y
secar al aire.
Contrateir en hematoxilina
acuosa durante 1 min.
Azular con agua del grifo a
baja presin durante 1 min y
secar al aire.
Resultados e interpretacin

El producto de reaccin es rojo brillante.

Queda confinado a las clulas de las series de los neutrfilos y en los

mastocitos. La actividad de la CAE citoplasmtica aparece a medida que
los mieloblastos maduran a promielocitos.

Las clulas mas tardas se tien fuertemente pero de forma menos

intensa. Resulta por tanto de utilidad como marcador de la maduracin
citoplasmtica en las leucemias mieloides.

En la leucemia promielocitica aguda, las clulas muestran una tincin

citoplasmtica masiva. Los mltiples bastones de Auer caractersticos se
tien positivamente, a menudo con un vaco central.
La cloroacetato esterasa da una tincin citoplasmtica fuerte
Reactivos

Fijador: Acetona formalina tamponada.

Tampn: Tampn fosfato

Solucin madre de depsito. -Naftil butirato 100 l en

5 ml de acetona.

Reactivo de acoplamiento. Fast Garnet GBC 15 mg.

Contratincin. Hematoxilina acuosa.

Mtodo

Fijar los frotis secados al aire

durante 30 s en acetona formalina
tamponada.
Anadir el Fast Garnet GBC a 50 ml de
tampn
Anadir 0,5 ml de la solucin -naftil
butirato/acetona.
Verter el medio de incubacin en una
cubeta de Coplin durante 20-40 min.
Enjuagar completamente con agua del
grifo en la cubeta de Coplin hasta que
se aclare.
Secar al aire y contrateir con
hematoxilina acuosa durante 1-5 min.
Resultados e interpretacin

El producto de reaccin es marrn y granular.

La mayora de los monocitos (>80%) se tien

fuertemente, el resto muestra una tincin dbil.

Los neutrfilos, los eosinfilos, los basfilos y las

plaquetas son negativos.

Los linfocitos B son negativos y los linfocitos T se

tien de forma poco fiable.
Esterasa no especfica. Reaccin positiva (marrn) en la leucemia
normoctica aguda.
 Reactivos
Fijador: Acetona formalina tamponada.

Tampn: Tampn fosfato

Solucin de sustrato. Disolver 100 mg de -naftil acetato en 5 ml de ter monometil

etileno. Guardar a 4-10 C.

Reactivo de acoplamiento:
Pararosanilina de deposito. Disolver 1 g de pararosanilina en 25 ml de HCL caliente, 2
mol/l.
Solucin de nitrito sdico al 4%. Disolver 200 mg de nitrito sdico en 5 ml de agua
destilada.
Pararosanilina hexazotada. Mezclar volmenes iguales de pararosanilina y nitrito sdico al
4% durante 1 min antes de su utilizacin.

Medio de incubacin. Anadir 2 ml de la solucin de -naftil acetato a 38 ml de tampn

fosfato.

Contratincin. Hematoxilina acuosa.

Mtodo
Fijar los frotis secados al aire
durante 30 s en acetona
formalina tamponada fra.
Aclarar con agua del grifo y secar
al aire.
Sumergir las extensiones durante
30-60 min en el medio de
incubacin en una cubeta de
Coplin.
Enjuagar con agua del grifo a
baja presin en la cubeta de
Coplin hasta que se aclare y secar
al aire.
Contrateir en hematoxilina
acuosa durante 2-5 min.
Resultados e interpretacin

El producto de reaccin presenta una coloracin rojo/marrn

difusa.

Tanto los monocitos normales como los leucmicos se tien

fuertemente.

Los granulocitos normales son negativos.

Los megacariocitos se tien intensamente y los megacarioblastos

leucmicos pueden mostrar positividad focal o difusa.

La mayora de los linfocitos T y algunos linfoblastos T muestran

positividad focal punteada

Los eritroblastos leucmicos pueden mostrar positividad focal o

difusa.
Mtodo
Seguir el mtodo y los pasos 1-4 enumerados anteriormente para
la tincin con -naftil acetato, enjuagar con agua del grifo y
secar al aire.
Sin mas fijacin, preparar el medio de incubacin del naftol AS-D
cloroacetato como se ha explicado anteriormente, sustituyendo
los 10 mg de azul rapido BB por nueva fucsina hexazotada e
incubar durante 10 min.
Enjuagar con agua del grifo y contrateir con hematoxilina acuosa
durante 13 min.
Resultados e interpretacin

El ANAE da un producto de reaccin marrn y el CAE da un

producto azul brillante granular.

Los patrones de tincin son idnticos a los observados con los dos
colorantes utilizados separadamente.

En las leucemias mielomonocticas puede haber clulas que se

tian con ambas esterasas.

En la mielodisplasia y en la LMA con granulocitos displsicos

puede haber clulas individuales con doble tincin
LMA5 (monocitica) MO TINCION DE ESTERASAS
COMBINADAS: monoblastos teidos de marrones (esterasas no
especificas) y un neutrfilo teido de azul (cloroacetoesterasa)
 enumeracin
estados
basfilos y patolgicos
mastocitos

colorantes de
Romanowsky

grnulos

otros trastornos
LMA LMC mastocitosis adquirida
mieloproliferativos

displsicos escasa granularidad

Reactivos
Azul de toluidina al 1% p/v en metanol. Anadir 1 g de azul de toluidina
(BDH 34077) a 100 ml de metanol y mezclarlos durante 24 h (rodillo o
agitador magntico). estable a temperatura ambiente. Conservar tincin
en un ambiente cerrado.

Mtodo
1.Colocar los frotis secados al aire en una gradilla de tincin y
sumergirlos.
2. Incubar durante 5-10 min.
3.Enjuagar con agua (baja presin) hasta que se aclare y secar al
aire.

Resultados e interpretacin
Los grnulos se tien con un color rojo/purpura brillante
Los ncleos se tien de azul y las clulas con abundante ARN pueden
mostrar un tinte azul en el citoplasma.
incubacin es >10 min, los grnulos primarios de los promielocitos se tien
de rojo/purpura. (pequeos y sutiles)
Sndromes mielodisplsicos y leucemia mieloide aguda
trastorno pre leucmico clnico citoqumica es til para
adquirido de la medula sea, definir las clulas
caracterizado principalmente por una monocticas (ANAE y
medula celular o hipercelular, ANBE), para identificar los
citopnias perifricas y anomalas bastones de Auer y para
morfolgicas variables de las clulas poner de manifiesto la
hematopoyticas displasia

*Perls hemosiderina =
sideroblastos en anillo.

Otras pruebas citoqumicas de la displasia

son:
doble tincin de las clulas con el
cloroacetato y el ANAE,
presencia de neutrofilos (-) MPO o el
NSB y la presencia de bastones de Auer .
Tincin de negro Sudn B (NSB)
Mieloperoxidasa (MPO)
alpha-naphthyl-acetate esterase (ANAE),
alpha-naphthyl-butyrate esterase (ANBE)
Diagnostico y clasificacin citologa, seguida de immunofenotipificacin.

citoqumica
Romanowsky Linfoblastos, grnulos azurfilos finos (ocasiones).
bastones de Auer y la MPO y la CAE (negativas), haya o no grnulos finos.
??grnulos, presentan una reaccin dbil con el NSB.

*patrn de positividad al PAS; 95%. bloques o grnulos de material rojo brillante

muy pocos blastos (<1%) o en la mayora. La diferencia (+). en otras
clulas leucmicas es el fondo cristalino del citoplasma en los linfoblastos.
Los mieloblastos, los monoblastos, los eritroblastos leucmicos y los
megacarioblastos muestran algn grado de (+) citoplasmtica difusa y, en
ocasiones (+) en bloques.

fosfatasa acida
mas probabilidad (+) focal en las leucemias agudas de los linfocitos B
*diferencia no es lo suficientemente (diagnostica)
? (+) focal en los eritroblastos de las eritroleucemias.

Esterasas, poco til; algunos casos de linfocitos T (+) focal con ANAE
(inespecfica).
Trastornos mieloproliferativos crnicos

valores bajos (FAG ) Tpicos fase crnica de la LMC

valores elevados
otros trastornos mieloproliferativos,
*demasiado inespecfico
para tener utilidad
diagnostica.

Trastornos linfoproliferativos crnicos

(inmunofenotipado)
Las reacciones para las hidrolasas Focal; trastornos de los
acidas (fosfatasa acida, ANAE, - linfocitos T
glucuronidasa y -glucosaminidasa) trastornos de los linfocitos B.

La reaccin de la fosfatasa leucemia de las clulas peludas

acida
(resistente al tartrato)

nica tincin citoqumica con la especificidad suficiente

Diagnostica
 Peroxidasa PAS Fosfatasa Fosfatasa Esterasa sin Esterasa con
Sudn Black Alcalina Acida Fluor Fluor
Mieloblasto Negativo a Negativo Negativo Negativo Dbil + Dbil +
Granular +
Promielocito Granular +++ Granular fino + Negativo a + Difuso + + +

Mielocito Granular ++ Granular fino ++ Negativo a + Difuso + ++ ++

Metamielocito Granular ++ Granular fino Negativo a + Difuso + + +

+++
Segmentado Granular ++ Granular fino + Negativo a + Difuso + + +

Eosinofilo Granular ++ Negativo a + Negativo Difuso ++ + +

Basofilo Granular +++ Negativo a + Negativo Negativo Negativo Negativo

Monocito Dbil a Negativo a + Negativo Negativo +++ Negativo a +

Granular +
Linfocito Negativo Granular Negativo Clulas T, focal Dbil positivo Dbil +
grueso, +
mazacote
Normoblasto Negativo Negativo Negativo Negativo ++ ++

Megacariocito Negativo Fino granular + Negativo Difuso +++ +++ Negativo a +