SOUTHERN BLOT

Ing. Isaac Armendriz

2017
 INTRODUCCIN
Es una tcnica esencial de Biologa Molecular, diseada por E.M.
Southern en 1975.
Se basa en la transferencia capilar de fragmentos de restriccin de
ADN de un gel de agarosa a una membrana de nitrocelulosa, de esta
manera el patrn de restriccin de una muestra se reproduce en la
membrana.
El ADN inmovilizado en la membrana ahora puede ser marcado con
una sonda radioactiva, que identifique un gen especfico.
Es un mtodo para detectar un fragmento especfico dentro de un
gran grupo.
 Bases de la Tcnica
Un gel de electroforesis con fragmentos de restriccin de ADN se une
a una membrana de nitrocelulosa y se coloca debajo de una torre de
papel absorbente. Adems el gel esta sumergido en una solucin
altamente salina.
Debido a la presin y al papel absorbente la solucin salina sube por
capilaridad y transporta al ADN desde el gel hasta la membrana.
Este proceso dependiendo del tamao de los fragmentos puede durar
hasta 18 horas.
 Preparacin de componentes
PREPARACIN DEL ADN:
La muestra de ADN sea de origen vegetal, animal o bacteriano, debe ser
purificada con el mayor cuidado posible, de manera que la menor cantidad
de contaminantes estn presentes.
PREPARACIN DEL GEL CON FRAGMENTOS DE RESTRICCIN:
El gel debe ser pre-tratado sumergindolo en HCl por 30 min y despus en
una solucin alcalina por 30 min y finalmente se regula el pH en un buffer
de Tris.
Esto con el objetivo de separar las molculas de ADN para que se
transfieran fcilmente a la membrana y denaturar la doble cadena de ADN,
para facilitar la hibridacin.
 Preparacin de componentes
BUFFER DE TRANSFERENCIA:
Es un buffer de alta salinidad llamado SSC (Citrato Salino de Sodio),
debe estar a una concentracin de 20X.
Despus de la transferencia se reduce la salinidad baando la
membrana en 2X SSC a 80C y se fija el ADN a la membrana con una
pequea dosis de irradiacin UV.
HIBRIDACIN ADN-ADN
Se trata de detectar un fragmento en especfico al hibridizarlo con
una sonda complementaria.
La sonda es generalmente marcada con un compuesto radioactivo (P
32).
 Pre-hibridacin e Hibridacin
La membrana con al ADN fijado es lavada con un buffer de
hibridacin que contiene la sonda marcada.
La membrana es lavada en buffers que contienen diferentes
sustancias que bloquean la unin de la sonda a sitios no especficos.
Esto se realiza de 15 min a 3 horas a 68C.

Hibridacin
Se realiza en buffer 2X SSC
Es un paso crtico donde se pueden generar productos inespecficos.
Por lo tanto el diseo de la sonda radioactiva es crucial.
 NORTHERN BLOT
Mismo principio de Southern blot pero con ARN
 APLICACIONES

Southern Northern

Identificacin de Expresin de genes

clones en cncer,
RFLP transplantes,
Genes recombinantes enfermedades, etc
WESTERN BLOT
Ing. Isaac Armendriz
2017
 INTRODUCCIN
Es una tcnica utilizada para identificar y separar protenas.
La mezcla de protenas es previamente separada por peso molecular,
por electroforesis en gel de poliacrilamida.
Las protena en el gel son transferidas a la membrana e incubadas con
anticuerpos marcados con fluorescencia que son especficos a la
protena de inters.
 INTRODUCCIN

Los anticuerpos que no

hibridizan son lavados de la
membrana.
La membrana es detectada en un
transiluminador donde solo las
bandas de la protena con el
marcador de fluorescencia van a
ser observadas.
 PASOS ESENCIALES
EXTRACCIN DE PROTENAS: Lisis celular y purificacin del grupo de
proteinas objetivo.
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA: Separar las protenas
por peso molecular en diferentes bandas, y facilitar el traspaso a la
membrane de nitrocelulosa o de nylon.
BLOTTING: Incubacin de las protenas en la membrana con el
anticuerpo primario y secundario, para la hibridacin.
DETECCIN: Exposicin a radiacin lumnica que permita la emisin
de seal por parte del anticuerpo marcado.
 Aplicaciones importantes
Prueba confirmatoria de VIH (anticuerpos)
Encefalopata espongiforme bovina
Enfermedad de Lyme
Mas enfermedades infecciosas