HPLC

High Perfomance Liquid Chomatography

 KELOMPOK 5

Risma Achmad H311 14 007

Yasinta Minggu H311 15 003
Annisa Iqriyah H311 15 517
Tri Hasari Ishak H311 15 317
 Kromatografi cairan ditemukan pada awal tahun 1900-an ketika
seorang ahli botani Rusia, Mikhail S. Tswett

Berkembang menjadi

kromatografi kertas HPLC GC

HPLC High Pressure Liquid
Chromatograph

High Performance Liquid

Chromatograph

HPLC adalah salah satu teknik pemisahan untuk

pemisahan, identifikasi, dan uji kuantitatif pada
suatu campuran. Metode ini cocok untuk senyawa
yang tidak mudah menguap, tidak stabil, dan
memiliki massa molekul besar.
 Pada dasarnya, HPLC sebenarnya berasal dari
kepanjangan High Pressure Liquid
Chromatograph karena tekanan yang tinggi
dibutuhkan agar cairan dapat mengalir melewati
kolom. Bagaimanapun, dengan perkembangan
dalam instrumentasi dan materialnya, namanya
berubah menjadi High Performance Liquid
Chromatograph mengacu kepada kemajuannya
dari segi pemisahan, identifikasi, pemurnian, dan
analisis kuantitatif dari molekul yang kompleks.
HPLC adalah salah satu teknik pemisahan
untuk pemisahan, identifikasi, dan uji kuantitatif
pada suatu campuran. Metode ini cocok untuk
senyawa yang tidak mudah menguap, tidak stabil,
dan memiliki massa molekul besar.
Prinsip Kerja HPLC
 HPLC memiliki prinsip kerja yang
mengacu pada bantuan pompa,
sehingga fasa gerak cair dialirkan
melalui kolom ke detektor. Cuplikan
dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak
dengan cara penyuntikan. Di dalam
kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran disebabkan
karena adanya perbedaan kekuatan
interaksi antara solut-solut terhadap
fasa diam.
 HPLC memiliki prinsip kerja yang
mengacu pada bantuan pompa,
sehingga fasa gerak cair dialirkan
melalui kolom ke detektor. Cuplikan
dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak
dengan cara penyuntikan. Di dalam
kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran disebabkan
karena adanya perbedaan kekuatan
interaksi antara solut-solut terhadap
fasa diam.
 Beberapa senyawa organik mudah terurai pada
pemanasan. Akan tetapi, kromatografi cairan
kinerja tinggi atau HPLC dapat menganalisis
cuplikan yang labil tersebut karena HPLC dilakukan
pada suhu kamar. Selain itu HPLC tidak terbatas
pada senyawa organik saja tapi HPLC dapat
menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-
senyawa anorganik. Keuntungan lain
dibandingakan dngan kromatografi gas, HPLC
dapat menganalisis cuplikan yang mempunyai
berat molekul yang btinggi atau titik didihnya
sangat tiggi seperti polimer. Tidaklah heran jika
HPLC menjadi populer dan banyak digunakan pada
masa sekarang sebagai metode analisis rutin di
berbagai bidang, seperti farmasi, kedokteran,
pertanian, lingkungan, industri makanan, dan
pertambangan.
 Jenis-jenis HPLC
Kromatografi Adsorbsi

Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-

senyawa yang agak polar. Partikel-partikel silika atau aluminium biasanya
digunakan sebagai adsorben. Gugus-gugus polar silanol pada permukaan
silika dan gugus-gugus polar aluminol pada permukaan alumina bertindak
sebagai tempat-tempat adsorbsi untuk molekul-molekul polar. Jenis
kromatografi ini menggunakan fasa gerak nonpolar seperti heksana dan
jenis kromatografi ini disebut kromatografi fasa normal. Untuk mengontrol
retensi solut, bisanya ditambahkan sedikit senyawa polar terhadap fasa
gerak, misalnya propanol atau air sebagai modifier. Modifier ini bersaing
dengan molekul-molekul solute untuk merebut tempat adsorbs. Waktu
retensi dapat diperpendek dengan menaikkan konsentrasi modifier.
Kromatografi Partisi
Retensi solut dan pemisahan dalam kromatografi partisi mirip dengan proses
ekstrasi cair-cair. Konsentrasi solut dalam masing-masing fasa cair dinyatakan
dengan koefisien partisi. Biasanya fasa gerak lebih polar daripada fasa diam
(kebalikan kromatografi adsorbsi) sehingga jenis kromatografi ini disebut juga
kromatografi fasa terbalik. Oleh karena fasa diam nonpolar hanya dilapiskan
maka fasa gerak harus tidak tercampur dengan fasa diam, kemudian fasa
gerak harus dijenuhkan dengan zat cair fasa diam untuk mengurangi erosi
lapisan fasa diam. Pemisahan senyawa-senyawa nonpolar dapat dilakukan
dengan kromatogrfi partisi ini. Salah satu kendala jenis kromatografi ini
adalah keterbatasan selektivitas sebagai akibat ketidakcampuran kedua fasa.
Kedua fasa berbeda dan beberapa senyawa sangat kuat terikat dalam salah
satu fasa. Dengan demikian beberapa senyawa tertahan kuat atau tidak
tertahan sama sekali pada fasa diam. Oleh karena keterbatasannya ini maka
jenis kromatografi partisi tidak digunakan lagi sebagai teknik analisis rutin.
Kromatografi Fasa Terikat
Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan
paling banyak digunakan pada saat sekarang. Diperkirakan dari dua pertiga dari
teknik pemisahan HPLC dilakukan pada fasa diam terikat secara kimia yang
dioperasikan dengan fasa terbalik. Dalam hal penerapan kromatografi fasa terikat
dan kromatografi fasa partisi memperlihatkan persamaan. Akan tetapi, sorben fasa
terikat terdiri dari silika yang dimodifikasikan secara kimia dengan rantai alkil.
Sebaliknya, fasa diam dalam kromatografi partisi terdiri dari partikel yang dilapisi
secara fisik dengan zat cair nonpolar. Fasa terikat mempunyai beberapa keuntungan.
Fasa terikat merupakan fasa yang stabil. Tidak seperti pada fasa yang dilapisi
secara fisik, setiap pelarut dapat pakai tanpa diubah selama proses pemisahan
berlangsung bila kepolaran solut-solut bervariasi. Kestabilan fasa terbalik
menyebabkan kolom mempunyai umur panjang dan keterulangan waktu rotensi
yang baik. Pada akhirnya, sifat ekomis dan penggunaan yang luas dalam fasa terbalik
membuat teknik ini dominan dalam kromatografi cair modern.
Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan
camuran ion-ion atau molekul-molekul yang dapat di ion-kan.
Ion-ion bersaing dengan ion-ion fasa gerak untuk
memperebutkan tempat berikatan pada fasa diam. Jelas,
muatan ini sangat penting dan pH fasa gerak dapat divariasikan
untuk mengontrol derajat ionisasi. Terdapat dua jenis penukar
ion : anionik (-NH4+X-) dan kationik (-SO2-A+). Suatu anion akan
bertahan pada kolom penukar anion tapi sangat terelusi pada
kolom penukar kation. Dasar pemisahan berasal dari
perbedaan afinitas senyawa bermuatan terhadap permukaan
penukar ion.
Kromatografi Eksklusi Ukuran

Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan

kromatografi ekslusi ukuran. Teknik ini berbeda dengan teknik-teknik
kromatografi lainnya karena di sini hampir tidak ada fasa diam. Interaksi
polar dan nonpolar di antara solut dan fasa diam pada dasarnya tidak di
harapkan karena hal itu mepersulit retensi. Pemisahan terjadi karena solut-
solut terdifusi masuk dan keluar pori-pori material paking kolom. Jelas
sekali bahwa ukuran masing-masing molekul mengontrol seberapa jauh
molekul dapat menebus pori-pori paking dalam. Molekul-molekul yang
lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan
dikenal dengan istilah volume terekslusi. Sebaliknya moleku-molekul kecil
menempati volume pori dan bertahan lebih lama. Retensi maksimum
terjadi ketika molekul yang cukup kecil terelusi dalam volume pori.
Instrumentasi Kromatografi HPLC
Fasa gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair
dan disebut juga eluen atau pelarut. Berbeda dengan
kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak
pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak
untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa
gerak hanya sebagai pembawa solute melewati kolom
menuju detektor. Sebaliknya, dalam HPLC, fasa gerak
selain berfungsi membawa komponen-komponen
campuran menuju detektor, fasa gerak dapat
berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa
gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor
penentu keberhasilan proses pemisahan.
 Persyaratan fasa gerak HPLC
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi
beberapa persyaratan berikut:
Zat cair harus bertindak sebagi pelarut yang baik untuk cuplikan yang
akan dianalisis.
Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran
yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram
Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada
kolom. Biasanya pearut disaring dengan saringan nilon berukuran
diameter pori 0,45 m. pompa vakum biasanya digunakan untuk
menyaring partikel kotoran sekaligus menghilangkan gas dari pelarut
karena gas dapat mengganggu fase line. Teknik preparasi eluen
diperlihatkan pada gambar 7.1
Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun.
Zat cair tidak kental. Umumnya, kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi
Poise).
Sesuai dengan detector. Contoh, untuk detector refractive index pelarut
harus mempunyai indeks bias yang berbeda dengan solute. Untuk
detector UV, pelarut tidak boleh menyerap cahaya pada panjang
gelombang yang dipakai.
Pompa

Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan

dengan jantung pada manusia yang berfungsi
untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom
yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat
digunakan dalam HPLC harus memenuhi
persyaratan:

Menghasilkan tekanan sampai 600 psi

(pons/in2);
Keluaran bebas pulsa
Kecepatan alir berkisar antara 0,1- 10 mL/menit
Bahan tahan korosi
 Terdapat tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki
keuntungan dan kekurangannya yaitu:

Pompa Reciprocating
Jenis pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut
yang dipompa dengan cara gesekan piston mundur-maju yang
dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak
langsung dengan pelarut.
Pompa Displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntuk) terdiri dari
tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor.
Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak
bergantung tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. Akan
tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut.
Pompa Pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan
tinggi. Pompa jenis ini murah tetapi mempunyai keterbatasan
kapasitas dan tekanan yang dihasilkan serta kecepatan alir
bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.
Pemasukan Cuplikan
Kadang kala, faktor ketidaktepatan pengukuran
HPLC terletak pada keterulangan pemasukan
cuplikan ke dalam paking kolom. Masalahnya,
kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom
dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena
itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil
mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu
diusahakan tekanan tidak menurun ketika
memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak.
Beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam
aliran fasa gerak.
 Beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam
sistem HPLC akan diuraikan:
Injeksi syringe
Alat yang paling dulu ada dan paling mudah untuk
memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe
disuntikkan melaui septum (seal karet) dan untuk ini
dirancang syringe tang tahan tekanan sampai 1500 psi.
Injeksi stop-flow
Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe dimana
aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada
ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke
dalam ujung kolom. Setelah menyabungkan kembali
kolom, maka pelarut dialirkan kembali
 Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan
paling banyak digunakan. Untuk memasukan cuplikan ke
dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah:
Sejumlah volume cuplikan disuntikan ke dalam loop
dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop
Kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi
injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.
Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran
volume dari 5 hingga 500 L. Dengan sistem pemasukan
cuplikan ini memungkinkan memasukan cuplikan ini
memungkinkan untuk memasukkan cuplikan pada tekanan
7000 psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia
dengan volume 0,5 hingga 5 L.
Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada
juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa
diam, tempat terjadinya pemisahahan campuran menjadi komponen-
komponennya. Bergantung keperluannya kolom utama dapat digunakan
untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap
komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan
keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector. Selain kolom
utama dikenal pula kolom pengaman (guard kolom).

Kolom Utama
Berbeda dengan kolom kromatografi gas, kolom utama untuk
HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5 sampai 30 cm dan
diameter dalam berkisar antara 4 sampai 10 mm. Kolom utama dipaking
dengan partikel berukuran antara 3-10 m. Dalam HPLC, kolom utama
diletakkan setelah sistem pemasukan cuplikan. Kolom utama yang paling
banyak dipakai berukuran panjang 25 cm, diameter dalam 4,6 mm, dan
dipaking dengan partikel 5 m. Kolom utama berukuran demikian
mempunyai harga N sebesar 40.000 sampai 60.000 plat/meter. Kolom
yang lebih pendek dengan partikel lebih kecil dapat memberikan jumlah
plat yang lebih besar.
 Fasa diam
Kolom utama berisi fasa diam dan jenisnya
bervariasi bergantung keperluan, misalnya dikenal
kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penukar ion. Fasa diam
jenis terikat ini dapat dibuat dengan mereaksikan silika
dengan alkilklorosilana yang dikenal dengan reaksi
silanisasi.
Kolom Pengaman
Kolom pengaman (guard column) disebut juga pra-
kolom karena diletakkan sebelum sistem pemasukan
cuplikan. Kolom ini berukuran pendek, 5 cm dengan
diameter 4,6 mm dan biasanya dipaking dengan partikel
silika berukuran lebih besar dari ukuran partikel kolom
utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu
untuk menyaring kotoran yang terbawa dalam fasa diam
dan untuk menjenuhkan fasa diam dalam rangka
menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran
pelarut.
Detektor
Berbagai detektor untuk HPLC telah
tersedia, walaupun demikian detektor
harus memenuhi persyaratan berikut:
Cukup sensitif
Stabilitas tinggi
Waktu respon pendek sehingga tidak
bergantung pada kecepatan alir
Mudah digunakan
Tidak merusak cuplikan
 Berikut adalah dua jenis detektor yang biasanya digunakan
pada HPLC yaitu:
Detektor UV
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian
senyawa-senyawa organik. Detektor UV terutama digunakan
untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik. Detektor UV
dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang sehingga
panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih
disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun
demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan
pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organik
menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang
tersebut.
Detektor elektrokimia
Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya
hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor
jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi
solut-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik
senyawa organik maupun anorganik.
Daftar Pustaka
Hendayana, S. 2010. Kimia Pemisahan.PT. REMAJA
ROSDAKARYA. Bandung.
Nurhamida. 2005. Penentuan Kondisi Optimum
HPLC untuk Pemisahan Residu Pestisida
Imidakloprid Profenofos dan Deltametrin pada
Cabai. Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian Indonesia.
7(2):87-93.
Siswanto, A., Fudholi, A., Nugroho, A.K.,dan
Martono, S. 2011. Validasi Metode HPLC untuk
Penentuan Aspirin dan Asam Salisilat dalam
Plasma Kelinci secara Simultan. Jurnal
Kefarmasian Indonesia. 6(2):68-78.