You are on page 1of 1

UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE

PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA


COORDENAO DE PESQUISA PIBIC
PIBIC/CNPq/UFCG-2009

AVALIAO DE PROTENAS RECOMBINANTES DE Leishmania


chagasi PARA TESTE DE SORO-AGLUTINAO RPIDA EM
LTEX E ELISA NO CALAZAR CANINO
ALINE ANTAS CORDEIRO1; KAMILA NUNES DE ARAJO2; GILZANE DANTAS NBREGA3; MARIA DAS GRAAS
NBREGA BATISTA4; EXPEDITO KENNEDY ALVES CAMBOIM5, PAULO PAES DE ANDRADE6, MARCIA ALMEIDA DE
MELO7

INTRODUO RESULTADOS E DISCUSSO


A leishmaniose visceral (LV) uma enfermidade causada por protozorio pertencente ordem Kinetoplastida, O emprego do meio NNN bifsico permitiu o isolamento de uma linhagem de L. chagasi, aps cerca de 30 dias
famlia Trypanosomatidae e gnero Leishmania (RIBEIRO, 1997). No Brasil,o agente etiolgico a Leishmania chagasi, de cultivo primrio. Aps repiques semanais, uma maior homogeneidade de formas promastigotas foi obtida. A
a Lutzomyia longipalpis o principal flebtomo transmissor e os ces constituem o principal reservatrio da doena; amplificao do DNA de cinetoplasto pelos primers E e F, especficos pra L. chagasi/ L. infantum, mostra que o parasita
sendo uma endemia de forte impacto na sade pblica. O controle tem sido feito pela identificao dos animais isolado de fato L. chagasi.
infectados por sorologia e o sacrifcio destes. Entretanto, os mtodos empregados no diagnstico carecem de Com extrao do DNA do parasita empregando o kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen), obteve-se DNA de alta
sensibilidade e especificidade adequados e so de difcil padronizao, devido complexidade do antgeno. Protenas qualidade em quantidades adequadas para o PCR partindo de um precipitado contendo cerca de 5X107 promastigotas.
recombinantes podem contribuir para o desenvolvimento de novos ensaios diagnsticos mas apenas duas ganharam o A qualidade, averiguada por anlise em gel de agarose, mostra que os fragmentos de DNA obtidos so bastante
mercado, a rK39 e S7, que representam um fragmento da quinesina K39 e da HSP70 de L. chagasi ,e muitas esto j grandes (500 Kb) e que no h um rastro de DNA na regio do gel correspondente a fragmentos de 10 Kb ou menos.
patenteadas. As seqncias originais descritas por MELO (2006) para o gene SH01 foram novamente blastadas no NCBI.
Na dcada de 80, a importncia das protenas de choque trmico (Heat Shock Proteins HSP) como antgenos Sendo que, apenas o gene LinJ34.1100 de L. infantum mostrou uma elevada similaridade, tanto com a sequncia
majoritrios em vrias infeces parasitrias e bacterianas comeou a ser revelada. Adicionalmente, ficou evidenciada forward, localizada dentro da ORF do gene, como com a seqencia reverse, localizada na longa regio 3 no
uma variao importante da expresso das HSPs durante a diferenciao de diversos parasitas, no estresse provocado traduzida. Primers foram ento desenhados para amplificar a parte 3terminal da ORF, correspondendo a um
no momento em que o parasita se instala no vetor (ou cultivado em meio de cultura) ou quando exposto ao aumento polipeptdeo carboxi-terminal da protena SH01 de aproximadamente 300 aa. As seqncias so: Primer SH01 forward:
de temperatura aps inoculao nos hospedeiros vertebrados (FEDER & HOFMAN, 1999). 5 - TCG AAC GAT GAG CTG AAC A 3 e Primer SH01 reverse: 5 AGT GTC GCC TGG CAT ATT TC 3.
Na era genmica h um nmero crescente de seqncias de nucleotdeos de Leishmania, obtidos no s no Como controle positivo do experimento de clonagem foram desenhados primers para amplificao, clonagem e
projeto genoma, mas tambm de trabalhos individuais. Esses dados podem ser utilizados para estudar a funo de expresso do gene da HSP70 de L. chagasi. O segmento escolhido foi a parte 3 terminal, que codifica um polipeptdeo
diversos genes, podendo esclarecer aspectos da relao hospedeiro/parasita e eventualmente ser utilizados como de cerca de 270 aa, correspondente aproximadamente protena S7. As seqncias so: Primer HSP70 forward: 5
instrumento de diagnstico e ainda indicar possveis alvos quimioterpicos (GONTIJO & MELO, 2004). CAG GCC TTC ATC CTG ACG 3 e Primer HSP70 reverse: 5 TTA GTC GAC CTC CTC GAC CTT 3.
Este trabalho, prope-se estudar a expresso de vrios genes previamente identificados (MELO, 2006) como O uso do kit de purificao para os produtos de PCR permitiu obter uma banda nica consistente, sem dmeros
produzindo protenas antignicas de Leishmania chagasi, empregando um sistema heterlogo composto de uma de primers, tanto para o produto de SH01 como para o de HSP70 (dados no apresentados). Em seguida, foram feitas
linhagem de Escherichia coli e de um plasmdeo que, numa etapa posterior, ir facilitar a purificao da protena as ligaes destes genes e a transformao da hospedeira. Nos dois casos numerosos clones brancos foram obtidos.
quimrica gerada. Nenhum dos antgenos selecionados est descrito na literatura ou foi patenteado dentro ou fora do Aps repique em meio lquido e crescimento, as bactrias transformadas foram coletadas por centrifugao e
pas. solubilizadas em tampo de amostra para visualizao das protenas expressas. Vrios clones cresceram
vigorosamente em cultura, enquanto outros mostraram crescimento pobre. Na anlise em gel de SDS-poliacrilamida, os
clones com crescimento vigoros no se diferenciaram da linhagem no transformada. Os clones com crescimento
pobre, contudo, parecem expressar, mesmo sem induo com IPTG, quantidades significativas das protenas
MATERIAL E MTODOS recombinantes, com os pesos moleculares esperados (clones 4, 11 e 20) (figuras 1a e 1b).
Embora estes resultados tenham ainda que ser confirmados por western blot e PCR, eles indicam que a ligao
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratrio de Biologia Molecular do Semi-rido na Unidade Acadmica de pode conduzir, produo de plasmdeos sem inserto ou com fragmentos pequenos, que impedem a expresso da -
Medicina Veterinria no Centro de Sade e Tecnologia Rural da Universidade Federal de Campina Grande, Campus galactosidase, sem conduzir expresso da protena quimrica planejada.
Patos - PB. Uma vez confirmada a clonagem destes dois segmentos gnicos, o projeto seguir na purificao do produto e
A extrao de DNA do parasita, isolado de medula ssea de co sorologicamente positivo e mantido em meio uso em testes de ELISA e aglutinao rpida em ltex para o sorodiagnstico do calazar.
NNN com fase lquida composta de BHI, foi realizada com um kit comercial, empregando-se para tal o lavado da cultura
rica em promastigotas de L. chagasi.
Reao em Cadeia da Polimerase (PCR): Nesta etapa os trabalhos enfocaram genes de uma protena
hipottica e de uma protena com funo j comprovada: SH01 e HSP70, respectivamente. O gene da HSP70 foi includo
como controle do experimento, j que a expresso correta da sua poro 3 deve necessariamente permitir o isolamento
de um polipeptdeo antignico, a protena S7 empregada no sorodiagnstico canino no kit ELISA-S7 (Biogene Ind. &
Com. LTDA).
Os primers para cada gene ou regio gnica escolhida foram desenhados pelo programa Primer3, disponvel no
site http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm. Alm das caractersticas determinadas pelo Primer3 foram feitos ajustes no
primer forward para que a seqencia clonada ficasse no quadro de leitura do plasmdeo.
Os genes e regies gnicas do genoma nuclear de L. chagasi foram amplificados utilizando-se em uma reao:
tampo 1X, dNTP 250 M, 1 M de cada primer, 2U de Taq polimerase, 5 L de DNA (1/10) e gua destilada ajustada
para um volume final de 20 L. Em seguida, a amostra foi termociclada para amplificao do DNA de acordo com o
seguinte ciclo: 1-Desnaturao 95C por 3 minutos; 2-Desnaturao 95C por 30 segundos; 3-Anelamento 60C por 30
segundos; 4-Extenso 72C por 30 segundos; 5-Repetir 2 etapa, 40 vezes; 6-Extenso 72C por 10 minutos; 7-1 ciclo
4C infinito; 8-Fim (ARAJO et al., 2008 dados no publicados).
Foram usados como controle positivo do ensaio, primers espcie-especficos que pareiam com o kDNA (DNA de
cinetoplasto), descritos por LAMBSON (1999), com as seguintes seqncias: E: 5 CCA GTT TCC CGC CCC G 3; F:
Figura 1a: Perfil da expresso de protenas por E. coli Figura 1b: Perfil da expresso de protenas por E. coli transformada
5 GGG GTT GGT GTA AAA TAG G 3). Como controle negativo nenhum DNA foi adicionado ao mesmo mix da transformada pelo plasmdeo pQE-30 portando o inserto para o pelo plasmdeo pQE-30 portanto o inserto para o segmento carboxi-
reao para kDNA. segmento carboxi-terminal das protenas SH01 e HSP70. Os terminal das protenas SH01 e HSP70. Os nmeros aps a
A anlise dos produtos amplificados foi realizada por eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,2% (p/v), com nmeros, aps a descrio da presena ou no de induo, descrio da presena ou no de induo indicam o clone
tampo de corrida TBE 0,5X (0,045M Tris-borato e 1mM de EDTA, pH 8). A imerso do gel numa soluo de brometo de indicam o clone empregado. empregado.
etdio (0,5 g/mL) foi feita por 40 minutos e, posteriormente, observada em transluminador com luz ultravioleta.
Alternativamente, foi empregado o corante blue green.
Clonagem e expresso gnica: Para a purificao do produto de PCR, primeira etapa no processo de clonagem,
CONCLUSO
a amplificao foi feita utilizando o volume para 5 reaes convencionais de avaliao, descritas acima, com o volume A estratgia de se associar uma anlise bioinformtica de genes de um parasita com a clonagem direta de
final de 100 L, para obter maior quantidade de DNA. Logo aps a amplificao, foi feita a purificao do produto de PCR segmentos destes genes, seguida da expresso em um vetor bacteriano, pode ser a forma mais eficiente de se obter
dos genes ou dos segmentos de genes de interesse utilizando o kit QIAquick Spin. antgenos recombinantes para fins diagnsticos ou protenas para outros usos, produzidas por organismos heterlogos.
Logo aps a purificao, o DNA pr-amplificado ligado ao plasmdeo, usando o kit QIAexpressionist ,que
emprega a Escherichia coli M15[pREP4] com um plasmdeo de expresso pQE-30 e um repressor pREP4. O kit lana
mo do fato de que os produtos de PCR tm uma adenina adicional em cada nova fita, que podem parear com uma
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
uracila em cada uma das extremidades do plasmdeo pQE-30 linearizado, de maneira que a enzima ligase presente no FEDER, M. E., HOFMAN, G. E. Heat-shock proteins, molecular chaperones and the stress response: Evolutionary and
kit promove a ligao. Ecological Physiology. Annu Rev Physiol; v.61, p. 243-82, 1999.
Em seguida ligao, bactrias tornadas competentes, com lavagem em cloreto de clcio e magnsio, foram
transformadas e incubadas em meio com os antibiticos kanamicina (25 g/mL) e ampicilina (100 g/mL), pois os GONTIJO, C. M. F. & MELO, M. N. Leishmaniose Visceral no Brasil: quadro atual, desafios e perspectivas. Rev. Bras.
plasmdeos pQE-30 e pREP4 apresentam genes para resistncia a estes antibiticos. Para que ocorra expresso dos Epidemiol, v. 7, n. 3, p. 340-343, 2004.
genes inseridos na bactria, adiciona-se IPTG (isopropil--D-tiogalactosdeo) no meio, um anlogo da lactose que inativa LAMBSON, B., SMYTH, A., BARKER, D. Sequence homology within a minicircle class of the Leishmania donovani
o repressor lacZ e induz a transcrio do operon lac. Alm do IPTG, utiliza-se tambm o X-gal, que ser degradado pela complex. Mol Biochem Parasitol. v. 25, n.101, p. 229-32, 1999.
-galactosidase. Desta forma, aparecendo colnias azuis, mostra-se que o plasmdeo se fechou sem o inserto. J
colnias brancas indicam que o gene de interesse foi clonado e pode estar sendo expresso. MELO M. A. Isolamento de clones imunoreativos e caracterizao in silico de novos antgenos recombinantes
A anlise da expresso de protenas pelas bactrias transformadas, comparativamente linhagem parental no de Leishmania chagasi. 2006. 169 pp e dois anexos. Tese. Doutorado em Biologia Parasitria, Instituto Oswaldo
transformada, foi feita por separao eletrofortica em gel de SDS-poliacrilamida a 12%, corado com azul de Coomassie. Cruz/Fundao Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil.
RIBEIRO, V. M. Leishmanioses. Revista do Conselho Federal de Medicina Veterinria, ano III, n. 11, p. 13-14, 1997.
TAVARES, C. A. P., FERNANDES, A. P., MELO, M. N. Molecular diagnosis of Leishmaniasis. Expert Rev Mol Diagn, v.
1Bolsista PIBIC, aluna do Curso de Medicina Veterinria, Unidade Acadmica de Medicina Veterinria, UFCG, Patos - PB, 3, p. 657-67, 2003.
E-mail: aline.antas@hotmail.com
2 Aluna do Curso de Medicina Veterinria, Unidade Acadmica de Medicina Veterinria, (UAMV) UFCG, Patos - PB,
SCHALLING, H. D. F. H. & OSKAN, L. Molecular biological applications in the diagnosis and control of leishmaniasis as
E-mail: kamila_vet@hotmail.com parasite identification. Trop Med Int Health, v. 7, p. 641-51, 2002.
3Aluna do Curso de Medicina Veterinria, Unidade Acadmica de Medicina Veterinria, UFCG, patos - PB, E-mail: gil_nobrega@hotmail.com
4Mdica Veterinria responsvel pelo Centro de Zoonoses de Caic RN, aluna do Curso de Especializao em Sade Pblica Veterinria,

UAMV, UFCG, Patos - PB, E-mail: gracanobregavet@yahoo.com.br


5Aluno do Mestrado em Medicina Veterinria de Pequenos Ruminantes, Unidade Acadmica de Medicina Veterinria, UFCG, Patos - PB,
AGRADECIMENTOS
E-mail: expeditok@hotmail.com Ao programa CNPq/PIBIC pelo financiamento do projeto de pesquisa, UFCG pela concesso da bolsa de Iniciao
6Professor Adjunto do Departamento de Gentica da UFPE, E-mail: andrade@ufpe.br
7Professora Adjunta da Unidade Acadmica de Medicina Veterinria, UFCG, Patos PB, E-mail: marcia.melo@pesquisador.cnpq.br
Cientfica e aos membros do Laboratrio de Genmica da UFPE e da Biogene Ind & Com. LTDA pelo apoio durante
a execuo do trabalho.

You might also like