Seminários de Imunologia III

Aluna: Thádia Evelyn de Araújo

Introdução
• Complicações da prematuridade;

• Parto no prazo x Parto prematuro

Aumento das contrações uterinas

Amadurecimento cervical

Ruptura das membranas fetais Prematura: P-PROM

P-PROM

TLR4: LPS
Resposta
Infecções TLR5: flagelina
inflamatória
TLR3: dsRNA poly
via TLR’s
(I:C)

• Citocinas pró-inflamatórias;
• Metaloproteinase (MMP)-9;
• Proteína quinase ativada por adenosina monofosfato: AMPk

Regulação da resposta inflamatória

In vitro: produção de IL-1β induzida por LPS;

In vivo: Inibição da produção de mediadores pró-inflamatórios
em ratos;

AMPk em placenta humana. Grávidas obesas

 Objetivos
Estabelecer o efeito do trabalho de parto espontâneo x trabalho de
parto prematuro na atividade da AMPK em membranas fetais humanas

Comparar a atividade de AMPK em membranas fetais obtidas de

membranas de gestantes com P-PROM e membranas fetais intactas;

Determinar os efeitos da ação de AMPK em infecção induzida por

mediadores pró-inflamatórios e indutores de parto;
 Metodologia
• Coleta de tecidos (membranas fetais):
• The Research Ethics Committee of Mercy Hospital for Women;

Partos prazo correto Partos prematuros (32,8 semanas):

• Cesárea sem trabalho de parto, • Cesárea sem trabalho de

membranas intactas; parto, membranas intactas;
• Parto normal espontâneo, com • Cesárea sem trabalho de parto,
ruptura de membrana; com P-PROM ;
• Trabalho de parto espontâneo,
parto normal.
N=6
 Ab monoclonal de camundongo anti-
Metodologia AMPKa1/2 (Thr172);
Ab policlonal de coelho anti-p-AMPKa1/2
(Thr172);
• Western blotting;
• Imunohistoquímica ;

Após estímulo com ativadores de AMPk e incubação com ligantes de TLR

(LPS, flagelina e poly (I:C)

• qRT-PCR;
• ELISA (IL-6, IL-8, TNF-α e IL-1β);
• Zimografia em gelatina;
Análise estatística;
 Cultura de explantes teciduais

• Determinar o efeito de ativadores de AMPK: AICAR, fenformin e A769662 em

membranas fetais humanas tratadas com LPS, flagelina e poly (I:C)

AICAR LPS
1h 20h
Tecidos Transferidos fenformina Flagelina -80C
mantidos para placa de
em cultura- A769662
24 poços Poly (I:C)
1h (DMEN)
 Cultura de células amnióticas
Âmnio: 2 cm da borda peri-placentária de mulheres que tiveram
cesárea (37-40 semanas de gestação)

Tiras lavadas Colagenase A Filtração Neutralização (FCS)

em PBS e tripsina em
meio DMEN
(35 min) Centrifugação (10 min – 500g)
Zimografia
em gelatina AICAR Células cultivadas
Meio
Incubação Troca de meio em DMEM/F-
fenformina
IL-1β (4h, 24h, 48h) 12, 10% FCS e 1%
qRT-PCR Células penicillin-
A769662 streptomycin
Resultados
Discussão

A ativação de AMPK pode inibir as respostas inflamatórias induzidas

por vários estimulantes;
Sem descrição em membranas fetais humanas e as respostas
inflamatórias que conduzem ao parto.
Novo papel para a AMPK na regulação de
mediadores pró-trabalho de parto em
membranas fetais humanas;
Discussão
• O parto humano é considerado uma resposta inflamatória;
Citocinas pró-inflamatórias .
aumentam a expressão de MMP nas membranas ruptura;

Concentrações de IL-8 estão significativamente correlacionados com a MMP-9 na

membrana durante dilatação cervical, que por sua vez é estimulada por IL-1β e
TNFα.
 Discussão
• Expressão da atividade de AMPK é diminuída em membranas fetais após trabalho
de parto espontâneo em comparação com membranas fetais não rompidas .

Diminuição da atividade de AMPk:

• macrófagos estimulados com LPS (Sag et. al, 2008)
• doenças neurológicas e metabólicas (Hardie et. al, 2013)
• Placenta de mulheres obesas (Rana et. Al, 2015).
Em membranas fetais de prematuros, na ausência de trabalho, a expressão
de AMPk foi diminuída com PPROM comparado a membranas íntegras que
foram artificialmente rompidos na cesariana.

• Isto pode sugerir que a AMPK regula os processos que levam à ruptura de
membranas.

• PPROM é molecularmente distinta do trabalho de parto prematuro;

ambos partilham a via de ativação da citocina pró-inflamatória, no entanto,
a ruptura da membrana é devido à ativação de MMP e vias apoptóticas .
• Células amnióticas estimuladas com IL-1β:
Secreção e expressão de MMP-9 - tratadas com AICAR, fenformina e
A769662.
• MMP-9: leva a PPROM .

Metformina, AICAR e A769662

Reduz a expressão de MMP-9 em células endoteliais da veia

umbilical, fibroblastos embrionários e estudos terapêuticos de
câncer (Esfahanian et. al, 2012; Morizane et. al, 2011).
 Ativadores de AMPK têm sido utilizados para neutralizar a
resposta inflamatória de várias doenças.

AICAR:
• Modelos murinos: encefalomielite experimental e asma - reduziu a produção de
citocinas pró-inflamatórias e lesão (Kim et. al, 2007; Nath et. al, 2005)
• Colite crônica e aguda (Bai et. al, 2010);
• inflamação na fibrose cística (Myerburg et. al, 2010)
• lesão pulmonar (Zhao et. al, 2008) .

Metformina,
• tecido cardíaco de ratos (Soraya et. al, 2012);
• concentrações plasmáticas baixas de MIF em obesos (Dandona et. al, 2004) .
Conclusão

Ativadores AMPK poderiam ser potenciais agentes terapêuticos através

da inibição da produção de mediadores pró-parto provocada por uma
infecção e / ou inflamação - fatores que levam ao parto prematuro
espontâneo.