Universidade Federal do Amazonas

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Pós-Graduação em Inovação Farmacêutica

Patrícia Danielle O. de Almeida

Manaus – AM
2016
 Câncer de cólon INTRODUÇÃO

 500.000 mortes por ano

 Causas: idade avançada, tabagismo, dieta, fatores ambientais,

hormônios exógenos, pólipos, história familiar, colite ulcerosa e doença
de Crohn.

 Tratamento: Cirurgia - insatisfatória em

casos de metástases e recorrência
Quimioterapia: 5-FU

 O desenvolvimento de novos agentes antitumorais são necessários de

modo a proporcionar tratamento de confiança para os pacientes.
 Derivados pirazol piridina INTRODUÇÃO

 Derivados pirazol : antitumoral, antibacteriana, anti-

inflamatório, analgésico, e antifúngica.

 Derivados de piridina: efeito antitumoral, com

inibição do crescimento celular, indução de
paragem do ciclo celular e apoptose

 Síntese do novo derivado pirazol piridina, 2- (4-

(2- (4- (dimetilamino) fenil) piridin-4-il) -5- (3-
metoxi-5-metilfenil) -1Hpirazol-1-il) acetonitrilo) •
KI – 10F 3.5HCl)
 Materiais e Métodos

Cultura de células

Linhagens:

 HT-29
 LoVo
RKO
 HUVEC

Cultura celular:
Meio de cultura RPMI -1640; DMEM e
M199 contendo 10% de Soro Fetal
Bovino (SFB) e 1% de antibiótico
Penicilina/Estreptomicina.

As células foram mantidas em estufa a 5% de CO2 e 37oC.

 Materiais e Métodos

Ensaio de viabilidade celular – Método MTT

24hs 48 hs
1 x 104 cells /poço TRATAMENTO Adição de 20 µL de MTT
100 µL/poço KI-10F e 5-FU: 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1e (2mg/mL)
5µM

Cálculo dos valores

de CI50

Remoção do sobrenadante
e adição de 200 uL de Incubar por 4hs em
Leitura – 540 nm
DMSO, agitação por 5´ estufa a 37oC 5% CO2
 Resultados e Discussão

Ensaio de viabilidade celular – Método MTT

CI50 = 0,30 µM CI50 = 0,59 µM

CI50 = 0,33µM

Figura 1: Efeitos citotóxicos de KI-10F e 5-FU em células

cancerígenas do cólon, (B) HT-29, (C) LoVo e (D) RKO. As
células foram avaliadas utilizando o ensaio MTT. Os
resultados são expressos como a porcentagem da
proliferação celular em relação ao controlo.
 Materiais e Métodos

Análise do ciclo celular

Mitose Defeito Defeito Defeito

norma na Mitose na Mitose na Mitose
l

Parada Parada Parada

na na na
Mitose Mitose
Mitose

Morte Derrapagem Derrapagem

Morte Senescência

Catástrofe mitótica
Fonte: Adaptado de GALLUZZI et al. 2012
 Materiais e Métodos

Avaliação do ciclo celular

Coleta e fixação em
HT-29 etanol 70% a 4oC
Tratamento das
células
24hs KI-10F : 0 a 1 µM 24 horas

Lavagem com PBS

Coloração: 50 µg/mL de PI +
100 µg/mL de RNAse

Citômetro de fluxo

Incubação

1 hora no escuro
Equipamento FACSCalibur
(Becton Dickinson, San José, CA)
Análise Quest (Becton Dickinson)
 Resultados e Discussão

Avaliação do ciclo celular

Figura 2. Efeito de KI-10F sobre a distribuição do ciclo celular em células HT-29. As células foram tratados com KI-10F (0,01 - 1 µM)
durante 48 horas, coradas com iodeto de propídio (PI) e, em seguida, analisadas num citômetro de fluxo FACSCalibur. M1, sub-G1;
M2, G0 / G1; M3, S; M4, G2 / M. A quantificação da coloração dados PI são apresentados como as percentagens de distribuição do
ciclo celular
 Materiais e Métodos

Análise da morte celular induzida por apoptose

Via apoptótica mediada por receptor de morte e via mitocondrial

FONTE: Adaptado (CIRCU; AW, 2010).
 Materiais e Métodos

Avaliação da morte celular - Coloração DAPI e ensaio TUNEL

HT-29
Fixação em PFA 2%
Tratamento das
células
24horas KI-10F : 5 µM
24 horas

Lavagem com PBS

Coloração: 2 µg/mL
DAPI – 20´ a 30oC

O ensaio Tunel foi realizado

utilizando o kit de TUNEL (Chemicon,
Temecula, CA), conforme orientação
do fabricante Análise da microscopia
de fluorescência
 Resultados e Discussão

Avaliação da morte celular - Coloração DAPI e ensaio TUNEL

Figura 2. (B) A indução de apoptose por KI-10F foi avaliada por coloração TUNEL e DAPI, cujos
resultados foram fotografados com uma ampliação de 200x.
 Materiais e Métodos

Avaliação da expressão de proteínas – Western blotting

48 horas

Células tratadas com KI-10F Lise das células Quantificação de Eletroforese em gel
proteínas desnaturante de
poliacrilamida

Revelação com reagente Lavagem da membrana e Lavagem da membrana e Transferência das proteínas do
quimioluminescente incubação anticorpo incubação anticorpo gel para membrana de
secundário primário nitrocelulose

Análise e interpretação dos

resultados
 Resultados e Discussão

Avaliação da expressão de proteínas – Western blotting

Figura 2: (C) A indução da apoptose por KI-10F foi avaliada por análise de Western blot da expressão
de Bcl-2, Bax e clivagem da caspase-3, -8 e -9 nas células tratadas com KI-10F nas doses indicadas
durante 48 h.
 Resultados e Discussão

Avaliação da expressão de proteínas – Western blotting

Figura 3. Efeito de KI-10F na angiogênese. (A) Expressão de HIF-1α e

VEGF pelo Kl-10F nas células HT-29 induzida por hipoxia (CoCl2, 100 uM).

Avaliação da formação de tubo – Ensaio de angiogênese sobre Matrigel
Células semeadas
Matrigel (200 ul) foi
polimerizada por 30´ a 37˚C.
0,2 ml de suspensão de
células foi adicionado a cada
poço revestido Matrigel
Materiais e Métodos
Ligação das células Formação de tubos
Células tratadas com as
concentrações indicadas
de KI-10F, incubadas Observação das alterações
durante 14 h. morfológicas e as formações de
tubo HUVEC realizado um
microscópio de contraste de
fase e fotografados com uma
ampliação de 200x.
 Resultados e Discussão

Avaliação da formação de tubo – Ensaio de angiogênese sobre Matrigel

Figura 3. Efeito de KI-10F na angiogênese. (B) Efeitos de KI-10F na formação de tubo HUVEC. As
HUVECs foram semeadas em Matrigel (200 ul / poço) e tratou-se com várias concentrações de KI-
10F. A formação do tubo capilar foi avaliada após 14 h e foi observada sob um microscópio de
contraste de fase e fotografados com uma ampliação de 400 x.
 Materiais e Métodos

Avaliação da migração celular

Células HUVECs plaqueadas

com 90% de confluência

Foram feitas
feridas com uma
lâmina de barbear
2 mm e marcado
na linha de lesão.

Após o ferimento, as células foram removidas e as HUVECs foram deixadas

migrar durante 24 h, posteriormente foram lavadas, seguido pela fixação com
metanol absoluto e coloração com Giemsa. A migração foi quantificada através
da contagem do número de células que se moveram para além da linha de
referência.
 Resultados e Discussão

Avaliação da migração celular

Figura 3. Efeito de KI-10F na angiogénese. (C) Efeitos de KI-10F sobre migração in vitro.
As HUVECs foram semeadas a 90% de confluência e um zero foi feita com uma lâmina de
barbear. Após o ferimento, as células foram incubadas em M199 com FBS a 5%, 5 ng / ml
de bFGF, timidina 1 mM e / ou Kl-10F (1 µg / mL).
 Materiais e Métodos

Avaliação da atividade antitumoral in vivo

Animais: camundongos C57BL/6 Inoculação: 2x106 células HT-29 Grupos

Condições: Mantidos em gaiolas, temp. Veículo: 200 µL de 0,7% CMC
ambiente (25 ± 3°C) com ciclo 5-FU 10 mg/Kg
claro/escuro de 12 horas, tratados com KI-10F 1 mg/Kg
alimentação e água “ad libitum”. VO 3 x por semana por 3 semanas

Avaliação do crescimento do tumor

 Resultados e Discussão

Avaliação da atividade antitumoral in vivo

Figura 4. Efeitos de KI-10F in vivo, utilizando um modelo de xenoenxerto de HT-29. Os tumores foram
implantados em camundongos por injeção subcutânea de células HT-29 (2x106 células / 200 µL de PBS) no
flanco. Após os tumores atingiram 50-100 mm3 de tamanho, os ratos receberam uma administração oral diária
de KI-10F (1 mg / kg), 5-FU (10 mg / kg) ou veículo (0,7% de CMC) durante 3 semanas. (A) O volume do tumor e
(B) de peso corporal alterações dos ratinhos nudes foram medidos antes do tratamento.
 Resultados e Discussão

Imunohistoquímica em tecido tumoral

 Conclusões

 Efeito antitumoral de KI-10F e os mecanismos associados

em modelo in vitro e in vivo.

 Inibição do crescimento celular e do tumor

 Indução de apoptose

 Supressão da angiogênese pela diminuição da expressão

de HIF-1α e VEGF e formação de tubos em células endoteliais.

 KI-10F (1 mg / kg) reduziu o crescimento tumoral mais

que o 5-FU (10 mg / kg), o qual é a droga utilizada na prática
clínica.