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Programa de Pós-Graduação em Odontologia

Área de concentração: Clínica Odontológica

MicroRNA-21 regula a diferenciação osteogênica de


células-tronco do ligamento periodontal tendo Smad5
como alvo

Doutorando: Arthur G. Schmidt


Orientadora: Profa. Dra. Denise Carleto Andia
ncRNAs
 RNAs não-codificantes (ncRNA, non coding RNAs) são moléculas
transcritas a partir do genoma e não traduzidas em polipeptídeos,
permanecendo geralmente no núcleo da célula, onde exercem sua
função principal de regulação da expressão gênica tanto
transcricional como pós-transcricional.

 A interferência por moléculas de RNAs não-codificantes que atuam


transcricionalmente é considerado um mecanismo epigenético, isto é,
uma mudança estável e herdável da expressão gênica ou do fenótipo
celular sem que haja alterações na sequência de bases do material
genético. Bartel, David P. «MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and
function». Cell. 116 (2): 281-297. ISSN 0092-8674. PMID 14744438. 2004
ncRNAs
 Os NcRNAs podem ser divididos em três grandes grupos em função de
seu tamanho. O microRNA (miRNA) e o RNA de interferência (siRNA, do
inglês Small interfering RNA) correspondem a moléculas bem
conservadas entre as espécies, com tamanhos entre aproximadamente
20 a 30 nucleotídeos.
 Os miRNA são tidos como produtos do genoma do próprio organismo.
São pequenas moléculas endógenas de ácido ribonucleico (RNA), não
codificantes, com cerca de 22 nucleotídeos que atuam como
reguladores da expressão gênica em plantas e animais, ao nível pós-
transcricional por meio da clivagem de um RNA mensageiro alvo (mRNA)
ou da repressão da tradução. Goldberg, Aaron D.; C. David. «Epigenetics: a landscape
takes shape». Cell. 128 (4): 635-638. ISSN 0092-8674. PMID 17320500. 2007
ncRNAs

 Recentemente, foi estabelecido que microRNAs (miRNAs)


desempenhavam papel importante na osteogênese de células tronco
mesenquimais (MSC).
 Novas populações de MSCs de tecidos dentais e craniofaciais, incluindo
células-tronco do ligamento periodontal (PDLSCs) e outras células-tronco
dentárias, têm sido propostas como fontes celulares adequadas para
regeneração dentária e periodontal.
 A diferenciação das MSCs envolve uma série de vias complexas que são
reguladas nos níveis transcricional e pós-transcricional
ncRNAs
 Recentemente, foi revelado que miRNAs poderiam modular o potencial de
diferenciação de células-tronco por fatores de transcrição pós-transcricional
implicados na manutenção de células-tronco. Evidências crescentes também
sugeriram que miRNAs também poderiam contribuir para a modulação da
diferenciação osteogênica de vários tipos de células e formação óssea
 Descobriu-se que o microRNA-21 (miR-21) está superexpresso na maioria dos
tecidos de câncer epitelial e constatou-se que sua inibição do suprime a
proliferação e promove a apoptose de células cancerígenas; ainda que o miR-21
poderia regular negativamente a expressão de supostos genes supressores de
tumor, tais como: PDCD4, fosfatase e tensina, maspin, NFIB , etc.
 Estudos prévios revelaram que o miR-21 aumentou a diferenciação osteogênica
induzida por estiramento em células-tronco do ligamento periodontal humano
(hPDLSCs)
MiR-21 diminuiu durante a
diferenciação osteogênica de hPDLSCs

 A diferencição osteogênica de hPDLSCs foi induzida num meio de indução


convencional de osteoblastos, sendo que o fenótipo osteoblástico foi
evidenciado por atividade aumentada de fosfatase alcalina (ALP) (Fig. 1B, C) e
mineralização de matriz como confirmado via coloração com Alizarina Red S
(Fig. 1B, D).
 Verificou-se que o miR-21 é regulado negativamente (down-regulated) de
maneira dependente do tempo após a indução da diferenciação osteogênica
em hPDLSCs (Fig. 1A ). Os miRNAs foram preparados no dia 0, 1, 3, 5, 7, 10 e 14
após a indução e utilizados imediatamente para análise de PCR em tempo
real. Na figura 1A o nível de miR-21 foi suprimido em hPDLSCs
osteoblasticamente diferenciadas.
A superexpressão do miR-21 diminuiu
a diferenciação osteogênica das
hPDLSCs
 Para avaliar o papel do miR-21 na diferenciação osteogênica de
hPDLSCs, hPDLSCs foi transfectado com uma construção lentiviral
pGC-LV-pre-miR-21-GFP projetada para estimular a produção de
miR- 21. Uma construção semelhante excluindo a sequência miR-21,
pGC-LV-miR-NC-GFP, foi utilizada como um controle.
 A superexpressão do miR-21 inibiu a diferenciação osteogênica das
hPDLSCs. A figura A monstra a análise microscópica de fluorescência
de hPDLSCs transfectadas, demostrando nenhuma diferença óbvia
em sua morfologia (200x).
A superexpressão do miR-21 diminuiu
a diferenciação osteogênica das
hPDLSCs
 Para elucidar o efeito da superexpressão de miR-21 na eficiência da
diferenciação de hPDLSC, as hPDLSCs transfectadas foram induzidas a se
diferenciarem ao longo de linhagens osteogênicas, seguido pela medição
da atividade de ALP (marcador precoce da diferenciação osteo-
dentinogênica), uma semana após a indução. Mostrou-se que o nível de
atividade de ALP era muito menor nos miR-21 superexpressando hPDLSCs
em comparação com o LV-NC e as células não infectadas (Fig. 2B, C).
 Para determinar se efeitos semelhantes poderiam também ser encontrados
in vivo , as partículas de suspensão celular e de hidroxiapatite / fosfato
tricálcico (HA / TCP) foram misturadas em conjunto e implantadas
subcutaneamente na superfície dorsal de ratinhos nus. Os resultados foram
os mesmos.
A inibição do miR-21 estimulou a
diferenciação osteogênica de hPDLSCs
 A regulação negativa do miR-21 em grupo miR-21 knockdown resultou em uma
série de mudanças moleculares e funcionais que foram antagônicas ao que foi
observado quando a superexpressão de miR-21 foi induzida, incluindo a
atividade de ALP elevada (Fig. 3B, C ) e uma maior extensão da mineralização
(Fig. 3B, D )
 Consistente com essas resultados, a análise qRT-PCR mostrou que os níveis de
mRNA de ALP, BSP, Runx2 e OSX foram drasticamente maiores no grupo
knockdown do que no grupo LV-anti-NC ou em células não transfetadas após a
indução (Fig. 3E-H ). Experimentos de implantação in vivo também
demonstraram que os hPDLSCs com miR-21 knockdown geraram mais tecidos
mineralizados do tipo osso / dentina do que as células que foram transfectadas
com pGC-LV-anti-miR-NC-GFP ou não infectadas (Fig. 3I ) .
MiR-21 inibiu a diferenciação osteogênica
em PDLSCs através de Smad5
 Para explorar o mecanismo molecular pelo qual o miR-21 inibiu a
diferenciação osteogênica em PDLSCs, foram realizadas análises de
bioinformática no miRGen 2.0 (www.targetscan.org, www.microrna.org ,
http://pictar.bio.nyu.edu ) para pesquisar seus potenciais genes alvo
downstream, sendo um dos resultados a proteína Smad5.
 O Western blot confirmou que a Smad5 foi regulada positivamente durante a
diferenciação osteoblástica de hPDLSCs não infectadas (Fig. 4A ).
 Após 7 dias de indução osteogênica, a expressão de Smad5 foi diminuída
em hPDLSCs superexpressando miR-21 em comparação àqueles que foram
transfectados com pGC-LV-miR-NC-GFP ou não infectados, mas
aumentaram em as células nas quais a expressão de miR-21 foi
artificialmente suprimida.
Efeitos do Smad5 na diferenciação
osteogênica de hPDLSCs
 Para determinar o papel de Smad5 na diferenciação osteogênica de PDLSCs, o
Smad5 foi duprimido usando siRNA. A eficiência de knockdown foi verificada por
PCR em tempo real e Western Blot. A avaliação da atividade da ALP e da
coloração com Alizarina Red S mostrou que o nível de atividade da ALP foi muito
menor (Fig. 5C, D) e a mineralização da matriz diminuiu nas hPDLSCs silenciando
Smad5 em comparação às células não transfectadas com Si-controle (Fig. 5C, E).
 O silenciamento de Smad5 inibiu a expressão gênica de ALP, BSP, Runx2 e OSX
após 7 dias de indução osteogênica (Fig. 5F-I ). Além disso, a expressão de Runx2
foi regulada negativamente (down-regulated) nas células Smad5-knockdown
(Fig. 5J ) e verificou-se ainda que o Smad5 é um regulador upstream do Runx2,
levando a níveis elevados de genes osteoblásticos, incluindo o Runx2.
 Foi demonstrado que a inibição do miR-21 que promove a diferenciação
osteoblástica pode ser atribuída ao estímulo da via de sinalização Smad5-Runx2
(Fig. 5K ).
( K ) Ilustração esquemática da hipotética via regulatória por meio da
qual o miR-21 modula a diferenciação osteogênica da hPDLSC via
Smad5.
DISCUSSÃO
 Os autores encontraram um nível de expressão diminuído de miR-21 em
hPDLSC osteoblasticamente diferenciadas, implicando seu papel como
um inibidor da osteogênese das MSC. De acordo com este achado,
vários genes osteogênicos, incluindo ALP, Runx2, BSP e OSX, foram
regulados negativamente em hPDLSCs superexpressando o miR-21.
Resultados opostos foram obtidos quando a expressão de miR-21 foi
suprimida.
 Os resultados experimentais não foram consistentes com os
mencionados no estudo de Meng, que sugeriu o miR-21 como um
estimulador da diferenciação osteogênica em MSCs do cordão
umbilical humano. É muito provável que a função reguladora exata do
miR-21 possa variar de acordo com o tipo de célula-tronco usada e as
condições fisiológicas aplicadas.
DISCUSSÃO
 O Smad5 mostrou-se um regulador upstream, promovendo a expressão
de Runx2 e vários outros genes marcadores osteogênicos, como ALP,
OSX e OCN. O nível desta proteína foi regulado negativamente pela
superexpressão de miR-21 sete dias após as hPDLSCs serem induzidas a
se diferenciarem.
 Por outro lado, a inibição do miR-21 aumentou a expressão de Smad5 e
inibiu a tendência de hPDLSCs para a diferenciação osteogênica.
 Vale destacar que o ensaio da luciferase sugeriu que o miR-21 mediou
os efeitos de diferenciação osteogênica direcionando diretamente
Smad5. Esses dados, combinados com os experimentos com animais,
sugeriram fortemente que o Smad5 é um alvo a downstream do miR-21
endógeno e serve como um regulador chave para a diferenciação
osteogênica em hPDLSCs.
DISCUSSÃO
 O nível de miR-21 aumentou após o knockdown de Smad5. Enquanto a
expressão de genes marcadores osteogênicos como ALP, BSP, Runx2 e OSX
diminuiu. Assim, a supressão de Smad5 mimetiza os efeitos da superexpressão
do miR-21. O Runx2 deveria ser upstream regulated mas agiu como um
efetuador downstream do Smad5 e assim, o nível de proteína Runx2 diminuiu
no grupo inibidor de Smad5.
 Dessa forma, especulou-se que a via de sinalização Smad5-Runx2 poderia
constituir um componente crítico subjacente ao mecanismo regulador miR-21
na diferenciação osteoblástica de hPDLSCs, conforme ilustrado
esquematicamente na Figura.

DISCUSSÃO
 Existem evidências crescentes de que outros miRNAs podem
desempenhar importantes papéis regulatórios na diferenciação
osteogênica de diferentes tipos de células-tronco. Por exemplo, a
inibição da atividade do miR-26a promoveu a diferenciação
osteogênica de células-tronco derivadas do tecido adiposo humano
(hADSCs) via Smad1 .
 Descobriu-se que o miR-135b inibe a diferenciação osteogênica de
MSCs humanas suprimindo a expressão de Smad5. Estes achados são
consistentes com a teoria amplamente aceita de que os miRNAs, seus
mRNAs e outros RNAs não-codificantes formam uma rede reguladora
extremamente intricada, na qual um miRNA pode ter múltiplos mRNAs e
diferentes miRNAs podem modular o mesmo mRNA.
Obrigado!