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CULTIVO CELULAR
Aline Silva
Eduardo Cabral
Helder Freitas
Kercy Sena
Barretos - 2018
CULTIVO CELULAR Sumário
Histórico do Cultivo Celular Criopreservação
George Gey
Alexis Carrel
Ross G. Harrison (células cardíacas de embrião de galinha)
Harrison
(fibras nervosas / tubo medular)
Wihelm Roux / Joly
(placa neural de embriões de galinha)
Cultivo de tecidos
fragmentados
Alexis Carrel
CULTIVO CELULAR Tipos de Culturas
Desvantagens
Proliferação Reduzida adesão célula-célula e célula-matriz;
in vivo Heterogeneidade e arquitetura tridimensional;
Espalhamento, migração e proliferação de
células não especializadas.
Proliferação
in vitro
Vantagens
Controle do ambiente;
Homogeneidade da amostra;
Economia;
Substituição dos animais em projetos de pesquisa.
CULTIVO CELULAR Tipos de Culturas
NÃO ADERENTE
Fonte: Setor de Cultura de Células do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), Fiocruz.
CULTIVO CELULAR Características das Células
ORGANISMO
ÓRGÃO TECIDO
NUTRIÇÃO
CULTIVO CELULAR Meios de Cultura
FLUIDOS SOLUÇÕES
BIOLÓGICOS SALINAS
EXTRATOS MEIOS
DE TECIDOS BASAIS
MEIOS
COÁGULOS
COMPLEXOS Harry Eagle
INDICADOR DE
CARBOIDRATOS
pH
ESTIMULAM A PROLIFERAÇÃO
CELULAR, MIGRAÇÃO, CÁLCIO, SÓDIO E POTÁSSIO
DIFERENCIAÇÃO E APOPTOSE
FATOR DE
CRESCIMENTO CÉLULAS SAIS
ALBUMINA,TRANSFERRINA
VITAMINAS
FIBRONECTINA
COFATORES DE
DIFERENTES ENZIMAS
CULTIVO CELULAR Meios de Cultura
CULTIVO CELULAR Suplementos
Soro Fetal Bovino (SFB): fração líquida do sangue coagulado do feto bovino, sem
células, fibrina e fatores de coagulação, contendo uma grande quantidade de fatores
nutricionais e macromoleculares essenciais para o crescimento celular.
Estimula o transporte de glicose, fosfato e aminoácidos e aumenta
a permeabilidade das membranas
TAMPONAMENTO
NATURAL (CO2)
CONTROLE pH
HEPES
VERMELHO FENOL
CULTIVO CELULAR Parâmetros físico-químicos
TEMPERATURA pH
37 °C 7,0 – 7,6
OXIGENAÇÃO OSMOLARIDADE
Resolução – RDC nº 50, de 21 de fevereiro de 2002. Regulamento Técnico para planejamento, programação,
elaboração e avaliação de projetos físicos de estabelecimentos assistenciais de saúde.
RDC Nº 222, DE 28 DE MARÇO DE 2018. Regulamenta as Boas Práticas de Gerenciamento dos Resíduos de
Serviços de Saúde e dá outras providências.
CULTIVO CELULAR Biossegurança
NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA 1
Manipulação de agentes da classe de risco 1, ou seja,
microrganismos que têm baixa probabilidade de
provocar doenças em homens ou animais.
ESPECIFICAÇÕES
Não são necessários equipamentos
específicos de proteção (barreiras primárias) e
quanto às instalações (barreiras secundárias)
são exigidas apenas bancadas abertas com
pias próximas.
CULTIVO CELULAR Biossegurança
NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA 1
Lavagem de mãos;
Não comer, beber e fumar.
Evitar o uso de calçados abertos;
Utilizar dispositivos mecânicos para a pipetagem, sendo proibido
fazê-lo pela boca;
Não usar acessórios como anéis, relógios e pulseiras durante as
atividades laboratoriais;
Possuir kit de primeiros socorros;
Realizar a desinfecção das superfícies de trabalho ao final do uso
ou quando houver contato direto de material viável;
Possuir programa de controle de insetos e roedores.
CULTIVO CELULAR Biossegurança
NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA 2
Manipulação de microrganismos que podem causar
infecção, mas que são de tratamento fácil e eficaz-
representando risco individual moderado e baixo para a
comunidade.
ESPECIFICAÇÕES
Uso de equipamentos de segurança, como luvas,
aventais e proteção para o rosto quando necessário.
Quando a manipulação de agentes provocar aerossóis
ou vazamentos de materiais infecciosos, é determinado
o uso de Cabines de classe I ou II.
Instalações: NB 1 + Autoclave
CULTIVO CELULAR Biossegurança
NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA 2
NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA 3
Destinado ao trabalho com agentes de risco biológico
de classe 3, potencialmente fatais, que apresentam
elevado risco individual e baixo risco para a
comunidade.
ESPECIFICAÇÕES
Equipamentos NB 2 + Cabines de classe I ou II
em todas as manipulações de agentes
abertas.
CULTIVO CELULAR Biossegurança
NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA 3
NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA 4
Exposição à agentes altamente patogênicos, de fácil
propagação, que não possuem medidas terapêuticas ou
profiláticas, representando um elevado risco individual e
para a comunidade.
ESPECIFICAÇÕES
Todos os procedimentos devem ser realizados dentro de
Cabine classe III ou em Cabines de classe I ou II,
juntamente ao uso do macacão de pressão positiva com
suprimento de ar.
CULTIVO CELULAR Biossegurança
NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA 4
Prática
Atenção
Treinamento
CULTIVO CELULAR Cultivo de Célula Animal
Área suja
Área limpa Saída
EPI’s
OU
CULTIVO CELULAR Manutenção das Células
Fonte:http://4.bp.blogspot.com/-
su56oP7ZeKY/ToiiTsDi5PI/AAAAAAAAAAQ/gO3q6tVDgLM/s1600/Sem+t%25C3%25ADtulo.png
CULTIVO CELULAR Manutenção das Células
Quantificação celular
CULTIVO CELULAR Manutenção das Células
Fonte: http://www.crh.com.br/allimg/galeria/fig9_1.gif
CULTIVO CELULAR Controle de Qualidade
Histórico da célula
Características
Comportamento do metabolismo
Meios de cultura utilizados
Teste de contaminação
Testes de compatibilidade
CULTIVO CELULAR Controle de qualidade
CONTAMINAÇÃO
Coloração Bactérias
Odor
Turbidez
Morfologia
Metabolismo
Fungos
CULTIVO CELULAR Controle de qualidade
CONTAMINAÇÃO POR MICOPLASMA: PCR
Bioluminescência (lise de micoplasma)
Não altera necessariamente a morfologia ou a Fluorescência (DAPI)
cinética de multiplicação celular; Microscopia de Varredura Eletrônica (MEV)
Taxa de crescimento alterada, alterações
morfológicas, aberrações cromossômicas,
alterações no metabolismo de aminoácidos e
ácidos nucleicos.
https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRftIdeirZ8xZ_tQHYNkF5MaiUycTiDf4LwmIWjnQ9w8lIxnKGB
http://3.bp.blogspot.com/-ZhvE4-Z8db8/Tkn5k0wsKuI/AAAAAAAACgc/6qjxacTe-1k/s640/chromosomenormalXtumor.jpg
CULTIVO CELULAR Controle de qualidade
http://www.nemumpoucoepico.com/wp-content/uploads/2013/04/SNP_STR.jpg
CULTIVO CELULAR Controle de qualidade
CULTIVO CELULAR Natureza do ensaio
CITOTOXICIDADE PROLIFERAÇÃO
Freshney, R. Ian. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications, 6th ed.
CULTIVO CELULAR
Freshney, R. Ian. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications, 6th ed.
CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Diluição de fármacos e citotoxicidade
Citotoxicidade é a capacidade intrínseca de um composto promover
alteração metabólica nas células em cultura, podendo culminar ou não em
morte celular;
IC50 → medida quantitativa que indica quanto de um determinado
fármaco ou outra substância ( inibidor ) é necessário para inibir um dado
processo biológico pela metade. Os valores são tipicamente expressos
como concentração molar ;
Curva de diluição.
Freshney, R. Ian. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications, 6th ed.
CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Diluição de fármacos e citotoxicidade
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CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Diluição de fármacos e citotoxicidade
Após a cultura ser tratada com a droga e encubada, o próximo passo será
começar os ensaios de acordo com o que o pesquisador deseja responder;
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Ensaio de MTT
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
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CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Ensaio de MTT
Sal de coloração amarela;
Reduzido na mitocôndria das células vivas, clivagem da enzima succinato
desidrogenase em cristais de formazan de coloração púrpura;
Os cristais de formazan acumulam-se como um precipitado dentro das
células, devido a isso, ele deve ser solubilizado antes da leitura em DMSO;
Cristais formados = Células viáveis
A densidade óptica (OD) resultante do Teste MTT é determinada em
espectrofotômetro.
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
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CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Ensaio de MTT
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
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CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Ensaio de MTT
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
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CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Ensaio de MTT
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
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CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Ensaio de MTT
MTT
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Ensaio de MTT
Esse melhoramento fez com não fosse mais necessário a adição de DMSO
na placa para solubilizar os precipitados de formazano.
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
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CULTIVO CELULAR Viabilidade celular
Ensaio de MTS
A diferença entre o teste de MTS e MTT está na estrutura dos corantes vitais;
▪ MTT, necessidade de utilizar o corante DMSO ou Isopropanol para
dissolver os cristais de formazan.
▪ MTS, os cristais formados são solúveis em água.
MENEZES, M. S. Papel do jaspamídeo na dinâmica do citoesqueleto de actina das células de melanoma : relação com migração e invasão. 2011.
CULTIVO CELULAR
Claire M. Wells and Maddy Parsons (eds.), Cell Migration: Developmental Methods and Protocols,
CULTIVO CELULAR Proliferação celular
Cicatrização de ferida (Wound healing)
Claire M. Wells and Maddy Parsons (eds.), Cell Migration: Developmental Methods and Protocols,
..........
CULTIVO CELULAR Proliferação celular
Cicatrização de ferida (Wound healing)
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CULTIVO CELULAR Proliferação celular
Cicatrização de ferida (Wound healing)
Ensaio de fechamento de ferida de célula de melanoma B16F10.
Claire M. Wells and Maddy Parsons (eds.), Cell Migration: Developmental Methods and Protocols,
CULTIVO CELULAR Proliferação celular
Ensaio de formação de colônia
Ensaio de sobrevivência celular in vitro baseado na capacidade de uma
única célula se transformar em uma colônia;
É utilizado para determinar a morte reprodutiva celular após o tratamento
(radiação, drogas).
Uma célula que retém sua capacidade de sintetizar proteínas e DNA e
passar por uma ou duas mitoses, mas é incapaz de se dividir e produzir um
grande número de progênies, é considerada morta.
BOROWICZ, S. et al., The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. 2014.
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CULTIVO CELULAR Proliferação celular
Ensaio de formação de colônia
Ensaio de sobrevivência celular in vitro baseado na capacidade de uma
única célula se transformar em uma colônia;
É utilizado para determinar a morte reprodutiva celular após o tratamento
(radiação, drogas).
Uma célula que retém sua capacidade de sintetizar proteínas e DNA e
passar por uma ou duas mitoses, mas é incapaz de se dividir e produzir um
grande número de progênies, é considerada morta.
BOROWICZ, S. et al., The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. 2014.
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CULTIVO CELULAR Proliferação celular
Ensaio de formação de colônia
BOROWICZ, S. et al., The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. 2014.
CULTIVO CELULAR Proliferação celular
BOROWICZ, S. et al., The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. 2014.
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CULTIVO CELULAR Proliferação celular
BOROWICZ, S. et al., The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. 2014.
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CULTIVO CELULAR Proliferação celular
BOROWICZ, S. et al., The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. 2014.
CULTIVO CELULAR Proliferação celular
BOROWICZ, S. et al., The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. 2014.
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CULTIVO CELULAR Proliferação celular
BOROWICZ, S. et al., The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. 2014.
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CULTIVO CELULAR Proliferação celular
BOROWICZ, S. et al., The soft agar colony formation assay. J Vis Exp. 2014.
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CULTIVO CELULAR Aplicações
INTERAÇÃO CÉLULA-CÉLULA:
Morfogênese, controle parácrino,
proliferação celular, cinética,
cooperação metabólica, adesão e
motilidade celular, interação
matricial, invasão. ATIVIDADE INTRACELULAR:
ENGENHARIA DE TECIDOS:
Transcrição de DNA, síntese de
Construções de tecidos, matrizes e
proteínas, metabolismo energético,
suportes, fontes de células-tronco,
metabolismo de drogas, ciclo celular,
propagação, diferenciação
diferenciação, apoptose.
Cultivo de
Células FLUXO INTRACELULAR:
FARMACOLOGIA: Ação de droga,
Processamento de RNA, receptores
interações de ligante receptor,
de hormônios, fluxo de metabólitos,
metabolismo de droga, resistência
mobilização de cálcio, transdução de
de droga. TOXICOLOGIA.
sinal, tráfego de membrana.
qPCR
DROGAS
Expressão gênica
Citometria de Fluxo
Viabilidade; imunofenotipagem
CULTIVO CELULAR Extração de DNA/RNA
Maior parte dos protocolos de extração de DNA/RNA consiste em duas partes:
Métodos de extração:
Fenol/Clorofórmio;
Resinas;
Kits comerciais.
CULTIVO CELULAR Extração de DNA/RNA
Fase Aquosa**
Proteínas, DNA
Fase Orgânica - 80C 1
hora
5. centrifugar a
2. centrifugar a
15.000 rpm por 15’
15.000 rpm por 15’ a
a 4C e lavar com
4C etanol
7. Diluição em
água DEPC (100 x)
*Para RNA: 1 DO = 40
CULTIVO CELULAR Protocolo RNA
Amostras
1 2 3
28s
18s
5s
CULTIVO CELULAR Aplicações
DESENHO EXPERIMENTAL – DROGAS
Dia: 0 3
qPCR
DROGAS
Expressão gênica
Citometria de Fluxo
Viabilidade; imunofenotipagem
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
COMPONENTES DE UM CITÔMETRO Eletrônicos
Fluidico
Óptico
(detectores)
Óptico
(lasers)
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
SISTEMA DE FLUIDOS
Vital para que as células passem pelo feixe de laser em
suspensão única;
Células injetadas em um fluxo de solução salina (fluido da
bainha);
Focalização hidrodinâmica;
Comprime o fluxo de células para aproximadamente 1 célula
de diâmetro;
A ótima "imagem" das células é obtida com uma taxa de
fluxo "baixa" e alta concentração de amostra.
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
O que é citometria de fluxo?
Análise de partículas individuais, muitas vezes células, dentro de uma suspensão
heterogênea.
Voltagem
Laser
Tempo
Voltagem
Laser
Tempo
Voltagem
Laser h
Tempo
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
Tamanho e granularidade usando citometria de fluxo
Side scatter
Forward
scatter
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
Fluidics
Detectores
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
FLUORESCÊNCIA
A intensidade de fluorescência emitida é proporcional aos locais de ligação
FITC FITC
FITC
FITC
FITC
FITC FITC
Número de eventos
FITC
FITC
FITC
Análise “multicolorida”
Ciclo de celular
Proliferação
Apoptose e Viabilidade Celular
Classificação de Células
Análise multiplex
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
GATES
Aplicação de Gates para análise de subpopulação
Estratégias simples de gating…
Populações Identificadas
CD4+/CDw29+ Helper/effector, more mature memory
CD4+/CD45R+ Suppressor inducer, less mature
CD4+/Leu8+ Suppressor inducer, some helper
CD4+/Class II MHC Activated cells, immature cells
CD4+/CD25+ Activated cells (IL2 receptor)
CD4+CD38+ Immature cells, activated cells
CD8+/CD11b+ Of the CD11b+ cells the suppressors
CD8+ CD8+/CD28+ Cytotoxic precursor/effector cells
CD8+/CD57+ Cytotoxic function
CD8+/Class II MHC+ Activated cells, immature cells
CD8+/CD25+ Activated cells (IL2 receptor)
CD8+/CD38+ Immature cells, activated cells
CD16+/CD57+ Low NK activity
CD16+/CD56+ Most potent NK activity
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
PROLIFERAÇÃO
CFSE
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
APOPTOSE
A apoptose resulta em vários eventos celulares que podem ser analisados por FACS:
Fragmentação de DNA (corante Hoechst)
Estrutura da membrana e integridade Annexin-V, PI)
Função mitocondrial (Mitotracker Red)
Atividade de caspase (ensaio de anticorpos)
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
VIABILIDADE
Detecção de apoptose usando captação de corante de viabilidade
7-AAD (DNA)
fosfatidilserina
FITC
PI
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
VIABILIDADE
Ensaio de anexina-V / PI para apoptose:
Fosfatidilserina normalmente no interior da membrana celular.
AnnV-FITC
fosfatidilserina
PI
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
SORTING
Permite que populações raras sejam
isoladas de populações heterogêneas
(cultura celular, amostras de sangue, etc)
Pode isolar partículas sub-celulares (por
exemplo, endossomos, núcleo,
cromossomos)
Permite que experimentos de transfecção
sejam enriquecidos e que clones de
células únicas sejam isolados
Pode produzir pureza> 95%
CULTIVO CELULAR Citometria de Fluxo
ENSAIOS FUNCIONAIS
Drogas
siRNAs Ensaios Bioquímicos
microRNAs
Vetores de Expressão Sinais de Repórteres
ETC...
Contagem Celular
Análises Morfológicas
Fenotipagem
Medidas
Microscopia
Automatizada (size, shape, intensity,
texture, etc.)
RISS, R T., et al. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. 2016
ZANDI et al., Antiviral activity of four types of bioflavonoid against dengue virus type-2. Virology journal.
2011.
MENEZES, M. S. Papel do jaspamídeo na dinâmica do citoesqueleto de actina das células de
melanoma : relação com migração e invasão. 2011.
Claire M. Wells and Maddy Parsons (eds.), Cell Migration: Developmental Methods and Protocols,