UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Facultad de Farmacia y Bioquímica

FRACCIONAMIENTO-SUBCELULAR:
Biomoléculas y métodos
bioquímicos
Prof. Francisco Abanto Zamora
 INTRODUCCIÓN
• CINCO OBJETIVOS:
1- Composición del cuerpo
2- Componentes de las células
3- Enfoque experimental y los métodos usados
en bioquímica
4- Principales logros
5- Lo poco que conocemos en ciertas áreas
 EL CUERPO HUMANO SE COMPONE DE UNOS CUANTOS
ELEMENTOS QUE COMBINADOS FORMAN UNA EXTENSA
VARIEDAD DE MOLÉCULAS (%)
• Carbono 50 Potasio 1
• Oxigeno 20 Azufre 0.8
• Hidrógeno 10 Sodio 0.4
• Nitrógeno 8.5 Cloro 0.4
• Calcio 4 Magnesio 0.1
• Fósforo 2.5 Hierro 0.01
• Manganeso 0.001
• Iodo 0.00005
• Los principales elementos son: carbono ,
hidrógeno , oxígeno y nitrógeno.
 Las cinco principales biomoléculas complejas son
DNA, RNA, proteínas, polisacáridos y Iípidos
complejos
• DNA  material genético
• RNA  molde para la síntesis de proteína
• Proteína  enzimas
• Glucógeno  almacena energía (glucosa)
• Lípidos  componentes de membrana y
almacén de energía como TG
 LA CELULA ES LA UNIDAD
BÁSICA DE LA BIOLOGIA
• Tres sucesos ayudaron al inicio de un periodo de
actividad sin paralelo en la bioquímica y la biología
celular. Fueron:
1 ) La disponibilidad creciente del microscopio
electrónico
2) La introducción de métodos que permiten separar
las células bajo condiciones relativamente poco
agresivas de modo que se preserve su función
3) El desarrollo y disponibilidad de una
ultracentrífuga refrigerada de alta velocidad
 El hepatocito de rata muestra características
comunes a muchas células eucariotas
• El hepatocito contiene todos los organelos
principales que se encuentran en las células
eucariotas ; es decir, núcleo, mitocondrias.
Retículo endoplásmico, ribosomas libres,
aparato de Golgi, lisosomas, peroxisomas,
membrana plasmática y ciertos elementos
citoesqueléticos.
 Para disgregar células y aislar moléculas
intracelulares y organelos subcelulares se usan
técnicas físicas
• Para estudiar con profundidad la función de
cualquier organelo, es necesario primero
aislarlo en forma relativamente pura, sin
contaminación importante de otros
organelos.
• El proceso habitual para conseguirlo se llama
fraccionamiento subcelular y, por lo general,
comprende tres procedimientos: extracción,
homogeneización y centrifugación.
 A. Extracción
• Como primer paso hacia el aislamiento de un
organelo (o molécula) especifico, es
necesario extraerlo de las células en que se
localiza.
• A la temperatura ambiente puede haber
pérdida significativa de la actividad, en parte
por la acción de varias enzimas digestivas
(proteasas, nucleasas, etc.), liberadas cuando
se rompen las células.
 Extracción /Cont.
• Una solución común para la extracción de
organelos consiste en sacarosa 0.25 mol/L
(isosmótica), ajustada a un pH de 7.4 con un
amortiguador de ácido clorhídrico-TRIS (tris
[hidroximetil] aminometano), 0.05 mol/L,
que contiene iones K+ y Mg2+ a
concentraciones casi fisiológicas; esta
solución se le conoce con las siglas STKM (del
ingles, Sucrosa, Tris, Kalium y Magnesium).
 B. Homogeneización
• Para extraer un organelo (o biomolécula) de las
células, primero es necesario romperlas bajo
condiciones suaves. Los órganos (hígado, riñón,
cerebro) y las células que contienen se pueden
separar de manera conveniente mediante el
proceso de homogeneización; éste consiste en
girar manualmente o por medio de un motor, un
agitador dentro de un tubo de vidrio de
dimensiones adecuadas que contiene los
fragmentos desmenuzados del órgano en
estudio en STKM.
 Homogeneización /Cont.
• La rotación controlada del agitador ejerce
una fuerza mecánica en las células y las
rompe liberando sus constituyentes en la
sacarosa. Resulta una suspensión que
contiene muchos organelos intactos, la cual
se conoce como homogenado.
 C. Centrifugación
• El subfraccionamiento del contenido de un
homogenado por centrifugación diferencial ha
sido una técnica de importancia capital en
bioquímica. El método clásico utiliza una serie
de tres pasos de centrifugación diferencial, con
velocidades sucesivamente mayores (figura) y
cada uno produce un sedimento y un
sobrenadante. El sobrenadante de cada paso es
centrifugado en el siguiente. Este procedimiento
proporciona tres sedimentos, que son las
fracciones nuclear, mitocondrial y microsómica.
Centrifugación /Cont.
Centrifugación /Cont.
PRINCIPALES ORGANELOS Y SUS MARCADORES

• Núcleo DNA
• MITOCONDRIAS Glutámico DH
• PEROXISOMAS Catalasa, oxidasa del ac. úrico
• LISOSOMAS Fosfatasa ácida
• Retículo endoplásmico Glucosa-6-fosfatasa
• Aparato de Golgi Galactosiltransferasa
• Citosol Lactato DH
 "marcador“
• Una enzima o un compuesto químico
"marcador“ es aquel que esta casi
exclusivamente confinado a un organelo
particular, como la fosfatasa ácida en los
lisosomas y el DNA en el núcleo . Por tanto, sirve
para indicar la presencia o ausencia, en una
fracción determinada, del organelo en el que
está contenido.
• El contenido del último sobrenadante
corresponde a la savia celular (citosol).
 El enfoque experimental tiene
tres componentes
• Los componentes principales del enfoque
experimental son tres: 1) el aislamiento de
biomoléculas y organelos (véase Centrifugación,
antes) contenidos en las células; 2) la
determinación de la estructura de las
biomoléculas, y 3) el análisis, utilizando diversas
preparaciones, de la función y el metabolismo
(es decir, síntesis y degradación) de las
biomoléculas.
 Aislamiento de biomoléculas
• FRACCIONAMIENTO SALINO PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO
• CROMATOGRAFÍA
EN PAPEL
POR INTERCAMBIO IÓNICO
POR AFINIDAD
EN CAPA FINA
GAS-LÍQUIDO
EN FASE LÍQUIDA A ALTA PRESIÓN
• FILTRACIÓN EN GEL
• ELECTROFORESIS
EN PAPEL
CON ALTO VOLTAJE
EN AGAROSA
EN ACETATO DE CELULOSA
EN GEL DE ALMIDÓN
EN POLIACRILAMIDA
POLIACRILAMIDA Y DODECILSULFATO SÓDICO (SDS)
• ULTRACENTRIFUGACIÓN
 Determinación de la estructura de
biomoléculas
• Análisis elemental
• Espectroscopia ultravioleta, visible infrarroja y de
resonancia magnética nuclear (RMN)
• Uso de hidrólisis ácida o alcalina para degradar la
biomolécula bajo estudio en sus constituyentes
básicos
• Uso de una serie de enzimas de especificidad
conocida para degradar la biomolécula (proteasa,
nucleas, glucosidasa, etc.)
• Espectrometría de masa; Cristalografía de Rayos X
• Métodos de secuenciación (proteínas o ac. Nucleicos,
etc.)
Análisis de la función y metabolismo de biomoléculas,
utilizando varias preparaciones

• La investigación bioquímica inicial en el ser

humano y los animales se hizo con el animal
intacto. Son ejemplos los estudios de la
respiración y el destino de las sustancias
ingeridas. Pronto se descubrió que el animal
íntegro era demasiado complejo para permitir
dar respuestas definitivas a numerosas
interrogantes. En concordancia, se hicieron
preparaciones más sencillas in vitro, que
eliminaron muchas de las complicaciones
experimentadas con el animal intacto.
 Estrategia general utilizada para analizar un
proceso bioquímico o una vía metabólica

• In vivo  in vitro
• Glucosa  Vía metabólica  ENERGIA

transcripción traslación
• DNA  RNA  PROTEINA
 BIBLIOGRAFIA
• Harper. Bioquímica ilustrada. 14 edición
• www.abanto90.wix.com/qftv