STUDIUL NADH-DEHIDROGENAZEI

LA BACTERIA PRODUCATOARE DE
BIOETANOL ZYMOMONAS MOBILIS
Autor: Dora Domnica Popescu
Coordonator: prof dr George Stoian
 Generalități privind biotehnologia

Biotehnologia se ocupă cu studiul oricărei tehnici care foloseşte

organisme vii (sau părţi ale acestora) pentru a obţine sau
modifica produse, pentru a îmbunătăţi caracteristicile unor
plante şi animale sau a dezvolta microorganisme cu întrebuinţări
specifice.
 Avantajele utilizării microorganismelor în
procesele biotehnologice
• prezenţa unui aparat enzimatic foarte bogat şi
foarte mobil;
• microorganismele au o mare capacitate de
biosinteză, ceea ce le permite să-şi procure
elementele necesare vieţii din cele mai variate
substraturi;
• agenţii biologici au o mare adaptabilitate la
condiţiile de mediu, chiar şi la cele mai vitrege;
• microorganismele se adaptează foarte uşor la
schimbările de mediu.
 Avantajele utilizarii bacteriei Zymomonas
mobilis
• Microorganism utilizat în producţia unor băuturi
alcoolice.
• Productivitate superioară în producţia de etanol
comparativ cu drojdiile;
• Randament superior în producţia de etanol,
selectivitate crescută;
• Toleranţă mare la pH-uri scăzute;
• Toleranţă mare faţă de etanol.
• Fermentează glucoza, fructoza, zaharoza
 Date despre biologia Zymomonas mobilis
1. Celule gram negative
2. Motile, în formă de bacili, cu dimensiuni de 1,0-2,0 x 4,0-5,0 μm, în mod
uzual întalnite în perechi
3.Nesporulate, fără capsule, fără lipide sau glicogen intracelular
4. Anaerobă, aerotolerantă
5. Glucoza şi fructoza sunt utilizate pentru a produce cantitaţi aproape
echimoleculare de etanol şi CO2, prin calea metabolică Entner-Doudoroff
6. Zaharoza este utilizată de multe tulpini şi este însoțită în multe cazuri de
biosinteza levanului
7. O mare varietate de zaharuri sau de acizi graşi nu sunt utilizaţi ca sursă de
carbon
8. Testele pentru indol, roşu de metil, metil carbinol, nitrit din nitrat, amoniac
şi de lichefiere a gelatinei sunt negative
9. Domeniul optim de pH= 7,00; domeniul de temperatură= 25-310C, care
facilitează creşterea tulpinilor
10. 47,5 până la 49,5% guanină plus citozină (G+C)
Abilitatea de a hidroliza sucroza nu este o caracteristică comună a Z. mobilis, dar
pare a fi dependentă de tulpini. În aceste tulpini capabile de a hidroliza sucroza s-a
stabilit că este implicată enzima levansucraza.

Structura 3D a levansucrazei de la
Zymomonas mobilis
 Proprietățile levanului
•Levanul este un polizaharid linear (2-6)--D-fructofuranozil cu un număr de legături (2-1)--D-
fructofuranozil.
•Are aplicaţii biotehnologice drept substituent de plasmă sangvină, sursă de fructoză, un
prolongator al efectului medicamentelor şi un imunomodulator specific.
•Levanul produs de Z. mobilis a fost estimat a avea o masă moleculară de 107 kDa.
•Temperatura şi pH-ul au o influenţă deosebită asupra producţiei de levan din Z. mobilis.
•La o temperatură de peste 34oC, formarea levanului este inhibată în toate tulpinile de Z. mobilis
examinate până acum.
•pH-ul optim pentru formarea levanului în culturile de Z. mobilis este de aproximativ 5,0 cu o mică
producţie de levan observată la un pH de 6,5 când rata hidrolizei sucrozei este optimă.
Surse de hrană. Substrat fermentativ-sorgul

Sorgul zaharat este o cultură de viitor pentru

producţia de biomasă pentru posibilitatea de a
produce la valori înalte etanol, energie şi DDG
(biomasă distilată uscată).

În diferiţii producători de etanol ultima reacţie a căii fermentative este o reducţie ireversibilă a acetaldehidei:
Acetaldehida + NADH+H+ etanol +NAD+

În Z. mobilis, reacţia este catalizată de enzima alcool dehidrogenaza (ADH).

În condiţii aerobe o parte din NADH generat în calea glicolitică Enter-Daudorff
este oxidat prin respiraţie. Lanţul respirator competiţionează pentru NADH cu
reacţia ADH. De aceea, randamentul producerii de bioetanol este mai mare în
condiții anaerobe
 Utilizarea NADH în respiraţie
Dacă ambele izoenzime ADH catalizează în sinteza etanolului, activitatea lanţului
respirator va fi prea slabă să combată reacţia ADH.

Schema pentru ciclul etanolului, prezentând rolul ADH II în respiraţie.

NADH dehidrogenaza stimulează creşterea aerobă la Zymomonas mobilis.

Se competiţionează pentru utilizarea
echivalenţilor reduşi între lanţul respirator şi
alcool dehidrogenază în cursul catabolizării
aerobe a glucozei în Zymomonas mobilis.
Consumul respirator de NAD(P)H limitează
reducerea acetaldehidei la etanol. Inhibarea
respiratorie este, dimpotrivă, cauzată de
acumularea de acetaldehidă.
 Identificarea enzimei NADH dehidrogenaza in
condiția creșterii bacteriene pe sorg
Materiale si metode

• mediul complet de creştere a conţinut yeast extract (drojdie) 0,5%, glucoză sau zaharoză 2%,
((NH4)2SO4 0,5%, KH2PO4 1%, MgSO4 0,5%.

• S-a folosit ca mediu de cultură extractul de sorg din următoarele soiuri: 64A, 66B, 68B, 68C, 70A
şi 70B obţinut prin fierbere.

• S-au utilizat următoarele tulpini bacteriene ATCC 10988, NCIB 11163, 11163-70, 11163-71,
11163-74, 11163-76, CP4PR, CP4PR3.

• Tulpinile bacteriene au fost crescute in mediu lichid complet la 30 gr C.

• Inoculul, aflat in faza exponentială de creştere, a fost însământat in mediu lichid, iar
creșterea celulară a fost monitorizată turbidimetric, pană la atingerea fazei târzii exponentiale
de creștere, prin urmărirea densității optice la 600 nm.

• Celulele au fost sedimentate prin centrifugare (8 000 g/ 20 minute) dupa care au fost
disrupte cu ajutorul unui ultrasonator. Materialul celular a fost apoi centrifugat timp de 15
minute/12 000g pentru separarea extractului celular de celule nedisrupte.

• Supernatantul colectat a fost apoi ultracentrifugat (100 000g, timp de 2 ore), retinandu-se
sedimentul membranar.
•NAD(P)H dehidrogenaza a fost extrasa din membrana bacteriană prin
efect “salting-in”, dupa care a fost parțial purificată prin precipitare cu
(NH4)2SO4, 30-60% saturație

•A urmat dializă în tampon Tris-acetat, 0,05M, pH 6, care a conținut 1 mM

EDTA.

• În continuare fracția cu activitate enzimatică a fost supusa evidenţierii

electroforetice.

• Concentrația proteica s-a determinat dupa metoda Lowry având

albumină serică bovină drept standard.

•Metoda Lowry combină reacția ionilor de Cu2+ cu legăturile peptidice și

reducerea aminoacizilor aromatici cu reactiv Folib-Ciocâlteu.

•Concentrația se determină spectrofomotetric prin măsurarea absorbanței

la 750 nm
 Rezultate și discuții
Pentru a putea caracteriza enzimele complexului NA(P)H dehidrogenazic este necesară o extracție
prealabilă a enzimei din membrana celulară.

Utilizarea detergenților neionici de tipul Triton X-100, Tween-80 sau a detergenților ionici precum
deoxicolatul de sodiu conduc la pierderea activitatii NADH oxidazice.

•S-a pregătit un preinocul în care fiecare tulpină de Z. mobilis s-a însămânţat pe fiecare tip de
mediu.
•S-a făcut apoi un inocul care s-a lăsat să crească până când a ajuns la densitatea optică de 0,4-
0,5 la 600 nm.
•S-a centrifugat la 4000rpm, 30 min, 4 gr C.
•S-a resuspendat sedimentul în ser fiziologic steril.
•S-a centrifugat la 4000rpm, 30 min, 4 gr C.
•S-a resuspendat sedimentul în ser fiziologic steril, în cantitate dublă densităţii optice.

•Din aceasta s-a însămânţat un volum egal în flacoane cu mediu steril:

- ptr curbe de creştere (de evoluție) se citeşte DO la 600 nm din oră în oră timp de minim 16
ore
- ptr curbe de consum s-au pus câte 500 microlitri ulei de parafină sterilizat şi s-au cântărit la
balanţa analitică din oră în oră, timp de minim 72 ore.
 Curbă de creştere pentru diferite tulpini
bacteriene crescute mediu special cu 2%
zaharoză

1,2
1
10988
DO 590nm

0,8
11163
0,6
11163/71
0,4
11163/76
0,2
0 CP4PR
0 2 4 6 8 10 PR3

Timpul (ore)

Curbă de creştere pentru tipul de Zymomonas

mobilis 11163 crescut pe mai multe soiuri de sorg,
2% zaharoză

0,3
0,25 70B
DO 590nm

0,2 70A
0,15 68C
0,1 68B
0,05 66B
0 64A
0 5 10 15
suc 2%
Timpul (ore)
 Curbă de consum pentru Zymomonas mobilis
11163-76 crescută pe diferite soiuri de sorg cu
zaharoză 2%

21,6
21,4 68B
21,2
Masa (g)
68C
21
66B
20,8
20,6 64A
20,4 70A
20,2 70B
0 50 100 150
suc 2%
Timpul (ore)

Curbă de consum pentru Zymomonas mobilis

CP4PR crescută pe diferite soiuri de sorg cu
zaharoză 2%

21,2
21 68B
Masa (g)

68C
20,8
66B
20,6
64A
20,4
70A
20,2 70B
0 50 100 150
suc 2%
Timpul (ore)
 Electroforeza în gel de poliacrilamidă
• S-a folosit detergent Nonidet P40 Substitute sol 10%

• S-a lucrat cu gel de poliacrilamidă concentrație 29%

Developarea gelurilor de PAA s-a efectuat astfel:

1. colorare 2 ore cu amestec coomasie blue / acid acetic / metanol / apă distilată (1/4/5, v/v/v)

2. decolorare de mai multe ori in reprize de cate o oră până când se evidenţiază foarte clar benzile
electroforetic cu soluţie de acid acetic-metanol- apă distilată (1/4/5, v/v/v).

S-au migrat probele în gel și s-au putut compara astfel calitativ (in
funcție de grosimea benzilor proteice) activităţile enzimatice ale
NADH dehidrogenazei și ale ADH la diferite tulpini de Z. mobilis
crescute pe soiuri diferite de sorg
Activitatea ADH
Activitatea NADH-Dehidrogenazei
 DETERMINAREA ACTIVITĂŢII LEVANSUCRAZEI
•Activitatea enzimatică a levansucrazei a fost urmărită prin creşterea concentraţiei de levan.

•Calcularea activităţii enzimatice a fost realizată cu ajutorul formulei:

A.E.=(D.O.finală- D.O.iniţială)/10* ε330*5

unde: D.O. a fost citită la 330 nm ; 10 a fost folosit pentru a aduce la echivalenţă cu 1 minut, iar 5 pentru a aduce la
echivalenţă cu 1 ml

•Polifenolii din extractele de sorg au fost determinaţi printr-o metodă descrisă de Folin-Ciocâlteu, iar drept etalon s-a utilizat
curba acidului galic.

Soiul de sorg Concentraţia de Soiul de sorg Conc polifenoli

zaharoză (%) (echivalenţi acid galic/ml
extract)
64A 19,52
64 A 143,8
66B 14,14
66 B 104,93
68B 9,76 70 A 72,5
68C 16,74 70 B 105,9
70A 11,95 68 B 78,64
69 B 149,77
70B 13,5
68 C 91,38
 CONCLUZII
• Compuşi fenolici din extractul de sorg par a intervini în procesele metabolice de
transformare a sucrozei în etanol, polifructani şi dioxid de carbon, procesul de
inhibiţie mamifestându-se la tulpini bacteriene specifice.

• Tulpina CP4PR pare a poseda mecanisme ce concură la contracararea efectelor

toxice ale polifenolilor din extractul de sorg.

• Soiul de sorg 70B pare a fi cel mai bine fermetat la etanol şi dioxid de carbon.

• După analizarea concentraţiilor de levan produse de diferite tulpini de

Zymomonas mobilis pe diferite soiuri de sorg s-a observat faptul că : 11163/76/70B,
PR3/sucroză, 11163/sucroză, 11163/71/64A, CP4PR/70B, CP4PR/66B, 11163/70B,
11163/71/66B produc o cantitate mare de levan.

• Totodată analizarea activităţilor enzimatice ale levansucrazei produse a dus la

concluzia că : 11163/70B, CP4PR/66B, 11163/66B, CP4PR/70B, 11163/64A,
CP4PR/sucroză produc cea mai mare cantitate de levansucrază.
Vă mulțumesc pentru
atenția acordată!