Efek Ekstrak Buah Kenari yang

Dimurnikan pada Metabolisme Lipid

pada Tikus yang Diinduksi Postnatal
Monosodium Glutamat dan 3T3-L1
Preadipocytes

Oleh :
Luk Luil Maknun
Vony Intan Prasasti
Fitria Dwi S.
Rabia Adhawiyah
Lisa yuhana
 Definisi LC / MS

◉ Liquid chromatography tandem mass

spectrometry merupakan salah satu Teknik
analitik yang menggabungkan kemampuan
pemisahan fisik dari HPLC dengan kemampuan
analisis massa (spektrofotrometri massa).
◉ LC/MS memiliki sensitifitas dan selektifitas yang
tinggi. Suatu senyawa akan dipisahkan dengan
liquid chomathography kemudian diidentifikasi
dan diukur dengan spektroskopi massa.
 Instrumentasi lc/ms

1. HPLC
◉ Prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri atas kolom (sebagai fasa
diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya.
◉ Pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong
fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai ke
detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan
teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya
terpisah (Himawan 2010).
2. Sumber ion
A. Ionisasi elektrospray (ESI)
 Ionisasi elektrospray (ESI) adalah metode yang digunakan untuk
analisis peptida, protein, karbohidrat, oligonukleotida kecil, polimer sintetis,
dan lipid. ESI menghasilkan molekul gas terionisasi langsung dari larutan
cair yang menghasilkan semprotan tetesan (droplet) dalam medan listrik.
Prinsip Kerja Instrument UHPLC
Prinsip Kerja Instrument ESI
Proses Setelah Analit Dipisahkan oleh LC
Proses Droplet Berubah Menjadi Analit
 Kelebihan Instrument LC-MS

◉ Dapat menganalisis lebih luas berbagai komponen,

seperti senyawa termal labil, polaritas tinggi atau
bermassa molekul tinggi, bahkan juga protein.
◉ Senyawa dipisahkan atas dasar interaksi relatif
dengan lapisan kimia partikel-partikel (fase diam)
dan elusi pelarut melalui kolom (fase gerak).
◉ Komponen elusi dari kolom kromatografi
kemudian diteruskan ke spektrometer massa
melalui antarmuka khusus (Gates 2005).
 Kekurangan Instrument LC-MS

◉ Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

◉ Hanya bisa digunakan untuk asam organic
◉ Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara
pelarut, analit, dan gradient elusi
◉ Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam
lingkup penelitian yang terbatas
 Aplikasi LC-MS

Bidang Farmasi Bidang klinik

- Identifikasi Bidang biokimia Deteksi sensitifitas
benzodiazepin trimipramin dan
- Identifikasi metabolisme
Identifikasi protein thioridazine dalam
asam empedu sampel urin

Bidang lingkungan Bidang makanan

- Deteksi herbisida fenil - Identifikasi aflatoksin
urea dalam makanan
- Deteksi rendahnya - Determinasi vitamin
tingkat karbaril dalam D3 dalam suplemen
makanan pakan ternak
 “
◉ Sampel : Ekstrak buah kenari

◉ Analit : monosodium glutamate,

3T3-L1
preadipocytes
◉ Hewan coba : tikus kunming
 Persiapan Ekstrak Polifenol Buah Kenari

◉ Buah kenari diekstraksi dengan 50% etanol (1:50, v / v)

menggunakan ekstraksi berkisanambungan, dengan t= 60 menit
pada suhu 73 C,  penyaringan.
◉ Filtrat dimurnikan di bawah kondisi optimum: konsentrasi larutan
sampel polifenol 4.0 mg / mL, nilai pH 4, laju influks 2 BV / jam,
volume influks 1,8 BV, eluent yang tepat menggunakan alkohol 75%,
laju alir elusi 4 BV / jam dan volume elusi 3 BV oleh resin HPD-100
(Liang et al., 2015)
◉ Filtrat murni  dipekatkan di bawah tekanan dan dikeringkan
menjadi bubuk kuning coklat. Kandungan polifenol, biasanya
digambarkan setara dengan asam galat (GAE) / 100 g (Singleton &
Rossi, 1965), diukur dengan Folin-Ciocalteu assay menggunakan
asam galat sebagai standar
 Analisis LC/MS

◉ Kromatografi : Agilent 1290 infinity series UHPLC instrument (Agilent

Technologies, USA)
◉ Poroshell Agilent Kolom EC C18 (50 3,0 mm, 2,7 lm
◉ Menggunakan 10 mM ammonium acetate dan ACN sebagai fase gerak pada
laju alir 0,4 mL / mnt Program gradien ditetapkan sebagai berikut (Tmin /
ACN,%): 0,0–0,5 / 20, 0,5–2,5 / 20, 2,5–3,5 / 90, 3,5–4,0 / 90 dan 4,0 / 20.
◉ Kolom suhu dan volume injeksi adalah 30 C dan 10 lL.
◉ Studi spektrometri massa dilakukan pada quadrupole time-of-flight
spektrometer massa resolusi tinggi (QTOF LC / MS 6540 series, Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, USA) digabungkan dengan ionisasi elektrospray
(ESI).
◉ Deteksi dilakukan dalam mode ESI negatif menggunakan nitrogen sebagai
pengeringan (350 C, 6 L / min) dan gas nebalkan (25 psi).
◉ MS, dioperasikan di parameter mode pemindaian ion negatif, adalah rentang
pemindaian m / z 100–1500 di bawah dioptimalkan tegangan fragmentor,
kapiler, dan skimmer pada 135 V, 3500 V dan 65 V masing-masing. Data
diakuisisi menggunakan perangkat lunak Mass Hunter Workstation.
 Hewan Percobaan

◉ Tikus Kunming (laki-laki: perempuan = 1: 1, 10 minggu) diperoleh dari

Chinese Academy of Medical Sciences, Institute of Hewan Laboratorium
Medis (Beijing, Cina) dengan bobot tubuh mulai dari 18 hingga 22 g.

◉ Setelah 2 minggu periode aklimatisasi, tikus betina berumur 12 minggu

dikawinkan dengan mencit jantan sebagai 1–1. MSG diberikan secara
subkutan pada dosis 3 mg / g / BW / d pada hari tikus yang baru lahir dari
2 hingga 8, dan sementara itu, jumlah garam yang setara dimasukkan
dengan cara yang sama pada volume yang sama dengan kelompok kontrol.

◉ Pada hari 21, tikus MSG laki-laki dan tikus salin disapih diikuti oleh makan
adaptif selama dua minggu. Pada usia 7 minggu, saline tikus kontrol
ditetapkan ke dalam kelompok kontrol normal (NC) (n = 10).

◉ Tikus MSG dibagi menjadi enam kelompok yang berbeda secara acak (n =
10) sebagai berikut: Grup MSG, WMP 400 mg / kg / BW, WMP 800 mg / kg
/ BW dan simvastatin 30 mg / kg / BB.
 Lanjutan…

◉ Semua tikus diberikan MSG secara oral sekali sehari selama 10 minggu ke
depan. Pada usia 15 minggu, kelompok NC, kelompok MSG, dan
pengobatan WMP kelompok (WMP 400 dan 800 mg / kg / BW) berpuasa
indeks glikemik. Tikus dipuasakan semalam (12 jam)  tes toleransi glukosa
oral (OGTT). Glukosa secara lisan diberikan oleh gavage (3 g / kg) dengan
dosis tunggal 30% air solusi, dan kemudian darah diambil dari vena ekor
untuk tes glikemik pada 0, 30, 60, 90 dan 120 menit setelah pemberian
glukosa (Seiva Chuffa, Braga, Amorim, & Fernandes, 2012).
 Lanjutan..

◉Pada usia 17 minggu, semua tikus dipuasakan semalam. Berat badan, panjang
dan lingkar pinggang tikus diukur. Darah sampel dikumpulkan dari vena ekor,
dibekukan pada 37 C selama 2 jam dan disentrifugasi pada 3000g selama 10
menit. Serum disimpan pada suhu 20 C.
◉Kadar serum kolesterol total (TC), triasilgliserol (TG), kolesterol high-density
lipoprotein (HDL-C), lowdensity lipoprotein kolesterol (LDL-C), adiponektin,
insulin, dan kadar glukosa dianalisis dengan protokol penggunaan kit dengan
lempeng pembaca (TACAN Infinite 200 PRO, Männedorf, Swiss).
◉Sampel hati (1 g), yang segera disimpan pada 20 C setelah panen,
dihomogenisasi dalam 9 mL saline disentrifugasi pada 3000g selama 15 menit
pada 4 C, untuk mengukur kadar kolesterol total (TC), triasilgliserol (TG),
kepadatan tinggi lipoprotein kolesterol (HDL-C), dan low-density lipoprotein
kolesterol (LDL-C). Selain itu, aspartat aminotransferase (AST), alanine
aminotransferase (ALT), glutathione peroxidase (GSH-Px), aktivitas superoksida
dismutase (SOD), dan malondialdehid (MDA) tingkat hati diukur dengan protokol
penggunaan kit dengan pembaca lempeng (TACAN Infinite 200 PRO,
Männedorf, Swiss).
 Pengaruh WMP pada sel 3T3-L1

◉Pra-adiposit 3T3-L1 dibeli dari Institut Kunming Zoologi, Akademi Ilmu Pengetahuan
Tiongkok (Kunming, Cina). 3T3-L1 pre-adipocytes tikus dikultur (37 C, 5% CO2) di
DMEM mengandung 10% FBS hingga mencapai pertemuan.
◉Sel kemudian dirangsang dalam medium diferensiasi yang dilengkapi dengan FBS
(10%), insulin (10 lg / mL), deksametason (0,25 mM), dan IBMX (0,5 mM). Setelah 48
jam, sel-sel dipertahankan dalam DMEM mengandung FBS (10%) dan insulin (10 lg /
mL) selama dua hari. Berbeda dosis WMP langsung ditambahkan ke media biakan
obati 3T3-L1 preadipocytes. Dalam 0–4 hari berikutnya kultur sel di DMEM dengan
10% FBS, 3T3-L1 preadipocytes secara bertahap berubah menjadi bentuk bulat
dengan tetesan lipid muncul di sekitar nukleus.
◉ Metode Red ole Oil: sel dicuci lembut dengan fosfat buffered saline (PBS) dua kali,
diperbaiki dengan 4% formaldehida segar di PBS selama 15 menit pada suhu kamar,
dan dicuci lembut dengan air tiga kali. Sel-sel diwarnai dengan disaring Larutan
minyak Red (60% isopropanol dan 40% air) selama 1 jam, dan difoto setelah dicuci tiga
kali dengan air. Untuk menentukan Isi TG dan TC dalam sel 3T3-L1, sel yang dirawat
dicuci ekstensif dengan fosfat buffered saline (PBS) dan dikerok dengan sebuah
scraper sel.
 Lanjutan…

◉Sel sedimentasi yang telah disentrifugasi pada 1000 r / min selama

3 menit  (+) 20 lL 0,01% Triton X-100, pembekuan berulang dan
pencairan 3 kali pada 20 C dan 37 C.
◉Setelah sentrifugasi untuk mengumpulkan supernatan, TG dan isi
TC supernatan sel lisat diukur (Eseberri, Miranda, Lasa, Churruca, &
Portillo, 2015) dengan protokol kit TG dan TC. Untuk meneliti lebih
lanjut kemungkinan efek pro-apoptosis dari WMP 3T3-L1
adipocytes, Annexin V-FITC / PI assay dilakukan menggunakan
aliran cytometry (BD FACSCalibur, Franklin Lakes, NJ, USA) untuk
kuantifikasi tahap awal dan akhir dari apoptosis oleh protokol kit
Annexin V-FITC / PI dan flow cytometer FACSCalibur (Kauerova,
Kos, Gonec, Jampilek, & Kollar, 2016).
 Hasil (Persiapan dan analisis UPLC-ESI-MS fenol
makanan kenari (WMP)

◉Kandungan senyawa polifenol adalah 0,5 mg GAE / mg dalam

Ekstrak WMP. Kondisi HPLC ditetapkan sebagai berikut: Waters
Sunfire C18 (4.6 250 mm, 5 lm) sebagai kolom kromatografi,
metanol dan larutan asam B-0,1% (v / v) sebagai seluler fase, laju
aliran 0,8 mL / menit, volume sampel 10 lL, kolom suhu pada 25 C,
UV 280 nm sebagai panjang gelombang deteksi, dan elusi gradien
(metanol: 0,1% asam metanoat dari 2:98 sampai 50:50 dalam 75
menit).
◉Sampel 0,1750 g bubuk WMP dilarutkan dalam Botol 10 mL
dengan tingkat GC 100% volume metanol, disaring dengan
membran 0,45 lm,
 Pengaruh WMP pada tikus yang diinduksi MSG

Tes toleransi glukosa

Pengaruh WMP pada organ, berat badan dan indeks lemak pada tikus
yang diinduksi MSG.
Pengaruh WMP pada serum tikus yang diinduksi MSG
◉ Tingkat serum TC, TG, LDL-C, dan glukosa secara signifikan
meningkat (p <0,01) setelah administrasi MSG (Tabel 2),
◉ sementara HDL-C dan adiponektin menurun secara signifikan (p
<0,01).
◉Hewan yang menerima WMP (400 mg / kg / BW dan 800 mg / kg
/ BB) memiliki secara signifikan mengurangi TG, TC, glukosa dan
insulin dibandingkan dengan Grup MSG, di antaranya TG menurun
36,49% dan 44,57%, TC sebesar 28,29% dan, 38,65%, glukosa sebesar
53,65% dan 64,10% dan insulin masing-masing sebesar 31,04%, dan
44,52%. WMP (800 mg / kg / BW) pengobatan serentak
meningkatkan HDL-C sebesar 19,38%, adiponectin tingkat 55,44%,
sedangkan LDL-C menurun 25,30%. Rasio lipid dari kelompok WMP
800 mg / kg / BW hampir sama kelompok kontrol positif yang
diberikan simvastatin 30 mg / kg / BB.
Pengaruh WMP pada indikator biokimia hati dari tikus yang diinduksi
MSG
 Pengaruh WMP pada sel 3T3-L1

Pengaruh WMP diferensiasi sel 3T3-L1

Pengaruh WMP pada apoptosis dari 3T3-L1 adipocytes
 Kesimpulan

◉Dua belas polifenol dalam ekstrak (WMP) dari kenari tanpa lemak
diidentifikasi dengan UPLC-ESI-MS, hasilnya didominasi dengan
glansreginin A, asam galat, asam ellagic dan asam ellagic 4-O-
xyloside.
◉WMP memiliki peranan dalam meningkatkan sindrom anti-
metabolik, mencegah peningkatan berat badan, memperbaiki
glukosa dan metabolisme lipid, meningkatkan aktivitas antioksidan
hati pada kerusakan hati tikus yang diinduksi MSG pasca lahir.
◉WMP juga menghambat adipogenesis dalam sel 3T3-L1 secara in
vitro.
◉Dari hasil tersebut, WMP dapat disarankan sebagai pengobatan
klinis guna mencegah dan mengobati sindrom metabolik
 Thanks!

ANY QUESTIONS?