Microscopía y técnicas de

estudio a nivel celular

Microscopía

Campo claro
Campo Oscuro
Ópticos Contraste de fase
Confocal
Fluorescencia
Tipos de
microscopios

Electrónicos Transmisión
Barrido
Algunos Conceptos…

Magnificación Resolución (D)

Distancia mínima a la cual

Aumento que logra el el equipo puede mostrar
equipo dos puntos como
entidades separadas
Algunos Conceptos…

¿De qué depende la resolución?

0,5 . λ
D=
n . senθ

¿Cómo
disminuir D?
Algunos Conceptos…

¿De qué depende la resolución?

0,5 . λ
Longitud de onda
del haz de luz FILTRO
D= AZUL
n . senθ
Algunos Conceptos…

¿De qué depende la resolución?

0,5 . λ
D=
n. senθ
Objetivo

q
LENTE CON
AN MAYOR
muestra
Algunos Conceptos…

¿De qué depende la resolución?

Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz
cuando pasa de un medio transparente a otro también
0,5 . λ transparente. Este cambio de dirección está originado

D= por la distinta velocidad de la luz en cada medio.

n . senθ nAire: 1 nAceite:1,5

Índice de
refracción

ACEITE DE
INMERSIÓN
Microscopio óptico

TORNILLOS DE

REVOLVER

EL PORTAOBJETOS
Microscopio óptico
Microscopio óptico - Campo claro

Eosinofilia
Microscopio óptico - Campo oscuro

Objetos brillantes
sobre un fondo
oscuro

Observar organismos
vivos sin necesidad
de tinción
Microscopio óptico - Campo oscuro

Treponema pallidum
Microscopio óptico - Contraste de fase

Aumenta pequeñas diferencias en el índice de

refracción y densidad en la célula

Observar organismos
vivos sin necesidad
de tinción

El anillo forma un cono hueco de luz.

El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse
respecto del rayo que siga de largo

luz sombra
Microscopio óptico - Contraste de fase
Microscopio óptico - Contraste de fase

Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos

Zygnema Filamentous Algae

Microscopio óptico - Interferencia

Mismo principio que el microscopio

de contraste de fase pero utiliza luz
polarizada

Permite la visualización detallada sin

teñir

Maximiza la diferencia entre los

índices de refracción entre las partes
de la muestra de forma de hacer
visibles los limites celulares
Microscopio óptico - Contraste de fase e interferencia

Contraste
de fase

Interferencia
diferencial
Microscopio óptico - Fluorescencia

Los objetos pueden también visualizarse

por la luz que ellos mismos emiten

Pasa sólo la λ que

permite la excitación
del fluorocromo

Restringe
infrarrojo
Microscopio óptico - Fluorescencia

Algunos “objetos” fluorescentes…

GFP
(Green fluorescent protein) Aequoria victoria
 Drpspphila

hela

Célula de cebolla (peroxisomas)

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Bacilos en división Mitocondria 60.000x

Bacteria fagocitada por un

macrófago

Herpes virus ensamblándose en el núcleo

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Glomérulo renal 1200x Espermatozoides bovinos

Piel humana
Célula en corte transversal
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Bacterias sobre un estoma Célula vegetal con cristales (falsa tinción)

Glób. Blanco Glób. Rojo

Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas

 Elevados costos de los equipos y una infraestructura

adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier
laboratorio.
 Altos costos de procesamiento de las muestras
 La manipulación de reactivos se torna peligroso por la
elevada condición toxica de los mismos.
 Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de
artefactos
 La complejidad de los equipos requiere de personal
técnico especializado.
 Proporciona resultados de amplia resolución y
magnificación
Técnicas inmunológicas
Técnicas inmunológicas

Introducción a las Técnicas

inmunológicas

ELISA
Western blot
Inmunohistoquímica
Inmunofluorescencia
Citometría de flujo
Técnicas inmunológicas - Inmunoglobulinas
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos

Anticuerpo
Linfocito B

epitope
Activación

Antígeno
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos

Antígeno

Epitope A
Epitope C

Epitope B
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales

Antigeno

Activación

Linfocitos B
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales

Sangre

Centrifugación
Suero

Purificación
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales

Antígeno

Cultivo de células
Sangrado tumorales

+
Purificación de
Linfocitos B
Fusión

Hibridoma
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales

Hibridomas

Screening: Búsqueda de hibridoma

positivo y aislamiento

Purificación de anticuerpos monoclonales

del sobrenadante de cultivo de los
hibridomas
ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Antígenos
Para detectar

Anticuerpos
ELISA

ELISA Para detectar Anticuerpos

Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

ELISA

ELISA Para detectar Anticuerpos

Lavado Anticuerpo 2º Revelado

ELISA

ELISA Para detectar Antígenos

Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

ELISA

ELISA Para detectar Antígenos

Lavado Anticuerpo 2º Revelado

ELISA
Técnicas inmunológicas - Detección indirecta
Técnicas inmunológicas - Complejo avidina/biotina

Biotina
Avidina
Técnicas inmunológicas - Detección indirecta

Antígeno

Ac. primario

Ac. secundario

Biotina

Avidina

Peroxidasa

Cromógeno

Cromóforo
Western blot

SDS PAGE Western blot

Gel

Transferencia

Membrana
Western blot

Bloqueo Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º

biotinilado

Avidina-peroxidasa Revelado

•Sustrato coloreado que precipita al reaccinar

•Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima
Inmunohistoquímica

Se corta en secciones muy

finas y se coloca en un
portaobjetos

Trozo de tejido

Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º
biotinilado

Avidina-peroxidasa Revelado
Inmunohistoquímica - Sustratos
Inmunohistoquímica - Revelado

Anti MMP-13 revelado con DAB

Contratinción hematoxilina
Inmunofluorescencia

Ficoeritrina
Fluoresceina

Rodamina

DAPI Bromuro Naranja

de Etidio de Acridina
Inmunofluorescencia

Rat neurons

N-myc/CD56
Inmunofluorescencia - colocalización

La colocalización permite
determinar si dos antígenos se
encuentran en el mismo lugar
(nucleo, vacuola, retículo, etc)
dentro de una célula
Inmunofluorescencia - colocalización
Citometría de Flujo

Citometría de Flujo
Célula Medida En movimiento

Medida de las propiedades de las células

mientras están en un flujo de líquido

Inmunofenotipificación
Viabilidad/apoptosis/Proliferación
Ciclo celular
Cambios en la superficie
Actividad enzimática
Citometría de Flujo

Marcación con
anticuerpos
monoclonales

Mezcla de células
Citometría de Flujo

La presión ejercida por una columna de

fluido obliga a las células a “enfilarse” de
a una
Citometría de Flujo

Columna de células
Citometría de Flujo

Laser

Detector
Citometría de Flujo

La luz que se detecta a 90 grados del

haz del laser (side) es detectada por el
Granularidad canal Side Scatter Channel (SSC)
La intensidad de la señal es
proporcional a la cantidad de
estructuras citosólicas en la célula
(gránulos, inclusiones, etc)

Tamaño
La luz que se detecta en la misma
dirección del laser (forward) es
detectada por el canal Forward Scatter
Channel (FSC).
La intensidad de la señal detectada se
relaciona con el tamaño, y el indice de
refracción de las células
Citometría de Flujo

Dado que FSC es proporcional al tamaño y SSC a las

estructuras internas, una correlación entre ellos permiten la
diferenciación de los distintos tipos celulares en una población
celular heterogenea

Granulocitos

Linfocitos
SSC

Monocitos
RBCs, debris,
Células muertas
FSC
Citometría de Flujo - Histograma
Cuentas

Intensidad de fluorescencia
Citometría de Flujo - Dot Plot
FL2

FL1
Citometría de Flujo - Dot Plot
Citometría de Flujo - Cell sorting
Citometría de Flujo
Citometría de Flujo