Uji Deteksi Biofilm dari Isolat Klinik

Kateter Urin Bakteri Entercoccus

faecalis dengan Congo Red Agar
dibandingkan dengan Tube Method
Proposal Skripsi
Mohamad yanuar prasetyo nugroho
102014191
 Latar belakang
Enterococci:
 E. faecalis
 E. faecium

 Bakteri MRSA ke-3 infeksi pada ICU (Van tyne, 2013)

 6-14% Infeksi nosokomial berasal dari perangkat medis invasif (Jass, 2003)

 Patogenesis Enterococci ≈ kolonisasi dan pembentukan biofilm

 Menurut NIH : 80% infeksi terjadi oleh biofilm≈urologi , mayoritas isolat

tips kateter urin(Hassan, 2011)

 Fungsi biofilm:
1. Resistensi antibiotik
2. Pertukaran material genetik
• Van Tyne D, Martin MJ, Gilmore MS. Structure, function, and biology of the Enterococcus faecalis cytolysin. Toxins (Basel). 2013;5(5):895–911.
• Jass J, Surman S, Walker J. Medical Biofilms: Detection, Provention and Control [Internet]. Vol. 100, John Wiley & Sons, Ltd. 2003. Available from:
http://doi.wiley.com/10.1002/0470867841
• Hassan A, Usman J, Kaleem F, Omair M, Khalid A, Iqbal M. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Braz J Infect
Dis [Internet]. 2011;15(4):305–11. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S1413-8670(11)70197-0
 : 109 Isolat enterococcal= 100% E. faecalis
(Mohamed, 2007) 50% E. faecium + Biofilm

: 59% Isolat E. faecalis pada Traktus Urinarius + Biofilm

(Dworniczek, 2005)

: 75% Patogen dari UTI + Biofilm (Baqai, 2008)

S. aureus : 75% + Biofilm
E. faecalis : 75% + Biofilm
E. coli : 40% + Biofilm

: Endodontik klinis ↓ Biofilm

(Duggan, 2007)

: 352 Isolat dari UTI + Biofilm

(Seno, 2005)
• Latorre JD, Hernandez-Velasco X, Wolfenden RE, Vicente JL, Wolfenden AD, Menconi A, et al. Evaluation and Selection of Bacillus
Species Based on Enzyme Production, Antimicrobial Activity, and Biofilm Synthesis as Direct-Fed Microbial Candidates for Poultry.
Front Vet Sci [Internet]. 2016;3(October):1–9.
• Niveditha S, Pramodhini S, Umadevi S, Kumar S, Stephen S. The isolation and the biofilm formation of uropathogens in the patients
with catheter associated urinary tract infections (UTIs). J Clin Diagnostic Res. 2012;6(9):1478–82.
• Kaiser TDL, Pereira EM, dos Santos KRN, Maciel ELN, Schuenck RP, Nunes APF. Modification of the Congo red agar method to
detect biofilm production by Staphylococcus epidermidis. Diagn Microbiol Infect Dis. 2013;75(3):235–9.
Permasalahan
1. Bakteri Enterococcus faecalis merupakan
penyebab tersering dari pembentukan
biofilm
2. Belum ada pemeriksaan deteksi biofilm
yang cepat dan mudah
Hipotesis
1. Uji Congo Red Agar dapat digunakan
untuk mendeteksi biofilm dari bakteri
Enterococcus faecalis
Tujuan Penelitian
 Tujuan Umum :
1. Ingin mengetahui metode CRA apakah
dapat digunakan untuk deteksi biofilm dari
Enterococcus faecalis

 Tujuan Khusus :
1. Mengetahui prevalensi biofilm dari bakteri
Enterococcus faecalis hasil isolasi kateter
urin
2. Membandingkan Tube method dengan CRA
dalam mendeteksi biofilm
Manfaat Penelitian
1. Mendapatkan metode deteksi biofilm
yang cepat dan mudah
2. Manfaat akademika
 Tinjauan Pustaka
1. Gambaran E. faecalis
Kingdom Bacteria ≈ Filum Firmicutes ≈ Famili Enterococcaceae ≈ Genus
Enterococcus ≈ Spesies Enterococcus faecalis

 Flora normal gastrointestinal, mampu sebagai patogen

 (-) spora, Fakultatif anaerob , Kokus gram (+), (-) Reaksi katalase hidrogen
peroksida, Ovoid, 0,5-1 μm, Rantai pendek, berpasangan / tunggal

 Mampu mendapatkan, mengakumulasi, dan berbagi elemen

ekstrakromosomal yang mengkode sifat virulensi > Kolonisasi, Self defense

 Gen-gen (agg, gelE, Ace, cyILLS, Esp cpd, fsrB) mengkode faktor virulensi

• Fraser SL. Enterococcal Infections: Background, Pathophysiology, Epidemiology [Internet]. Medscape. 2015.
• Suchitra U, Kundabala M. Enterococcus Faecalis-An Endodontic Pathogen. Endodontology [Internet]. 2006;11–3.
 2. Enterococcus faecalis dengan Kateter
Urin
 Infeksi enterococci : ISK, infeksi intra-abdominal, dan infeksi luka
bedah

 Patogen tersering pada ISK

 ISK : 40% Wanita pernah mengalami

 ISK di RS : 40% Infeksi merupakan infeksi nosokomial disebabkan

kateter (Fraser, 2015)

 Kateter: Jalur masuk bakteri menuju ureter / kandung kemih

 20% ISK rekuren≈membentuk biofilm

• Fraser SL. Enterococcal Infections: Background, Pathophysiology, Epidemiology [Internet]. Medscape. 2015.
 3. Konsep Biofilm
 Proses perlekatan kumpulan bakteri, jamur pada permukaan,
interaksi sel-sel, formasi mikrokoloni, pembentukan dan
pengembangan struktur biofilm tiga dimensi (O’Toole, 2000)

 Terbungkus dalam Ekstracellular Polymeric Substances (EPS) (Gunardi,

2014)

 Perlekatan dan produksi biofilm E. faecalis pada alat biomaterial :

(Mohamed, 2007)
1. Stent ureteral√
2. Kateter intravaskular√
3. Stent biliar√
4. Silikon √

• O`Toole G, Kaplan HB, Kolter R. Biofilm Formation As Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 2000;49–79.
• Gunardi WD. Peranan Biofilm dalam Kaitannya dengan Penyakit Infeksi. J Kedokt Meditek. 2014;15 No. 39a(6).
• Mohamed JA, Huang DB. Biofilm formation by enterococci. J Med Microbiol. 2007;56(12):1581–8.
 Mekanisme Pembentukan Biofilm
1. Perlekatan reversibel bakteri planktonik
ke permukaan
2. Perlekatan ireversibel
3. Pembentukan lapisan kompleks
biomolekul dan sekresi EPS
4. Biofilm memperoleh struktur tiga
dimensi
5. Detachment

• Soto SM, Soto SM. Importance of Biofilms in Urinary Tract Infections: New Therapeutic Approaches. Adv Biol
[Internet]. 2014;2014:1–13.
 Struktur Biofilm
 Matriks : 90% air + 2% EPS + 2-5% mikroba + 2% zat lain
 Monolayer : Linking film > Menebal > Membentuk bentuk ‘jamur’

• Jass J, Surman S, Walker J. Medical Biofilms: Detection, Provention and Control [Internet]. Vol. 100, John Wiley & Sons,
Ltd. 2003.
• Gunardi WD. Peranan Biofilm dalam Kaitannya dengan Penyakit Infeksi. J Kedokt Meditek. 2014;15 No. 39a(6).
 Kemampuan E. faecalis Membentuk
Biofilm
Faktor virulensi, genetik pada saat perlekatan maupun maturasi.

1. Aggregation Substance (AS)

2. Enterococcal Surface Protein(Esp)

3. Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules

(MSCRAMMs)

4. Pili

5. Polisakarida
• Dunny GM, Hancock LE, Shankar N. Enterococcal Biofilm Structure and Role in Colonization and Disease.
Enterococci From Commensals to Lead Causes Drug Resist Infect [Internet]. 2014;1–17.
• Garsin D a., Frank KL, Silanpää J, Ausubel FM, Hartke A, Shankar N, et al. Pathogenesis and Models of Enterococcal
Infection. Enterococci From Commensals to Lead Causes Drug Resist Infect [Internet]. 2014;1–57.
 Faktor yang Mempengaruhi
Pembentukan Biofilm E. faecalis
1. Efek Permukaan (Substratum)

2. Conditioning Film

3. Hidrodinamik

4. Karakteristik Media Cairan

5. Keadaan Permukaan Sel Bakteri

• Gunardi WD. Peranan Biofilm dalam Kaitannya dengan Penyakit Infeksi. J Kedokt Meditek. 2014;15 No. 39a(6).
• Kafil HS, Mobarez AM. Assessment of biofilm formation by enterococci isolates from urinary tract infections with
different virulence profiles. J King Saud Univ - Sci [Internet]. 2015;27(4):312–7.
 4. Biofilm Enterococcus faecalis dan Kateter
Urin
 Lingkungan > Tempat ideal perlekatan bakteri

 Mikroorganisme urease-producer > Biofilm producer

• Trautner BW, Darouiche RO. Role of biofilm in catheter-associated urinary tract infection. Vol. 32, American Journal
of Infection Control. 2004. p. 177–83.
• Choong S, Wood S, Fry C, Whitfield H. Catheter associated urinary tract infection and encrustation. In:
International Journal of Antimicrobial Agents. 2001. p. 305–10.
 5. Deteksi dari Perlekatan Bakterial dan
Biofilm
 Perlekatan bakteri :
1. Mikroskop Cahaya

 Biofilm :
1. TCP
2. Tube Method
3. Congo Red Agar (CRA)

• Jass J, Surman S, Walker J. Medical Biofilms: Detection, Provention and Control [Internet]. Vol. 100, John Wiley &
Sons, Ltd. 2003.
• Hassan A, Usman J, Kaleem F, Omair M, Khalid A, Iqbal M. Evaluation of different detection methods of biofilm
formation in the clinical isolates. Braz J Infect Dis [Internet]. 2011;15(4):305–11.
• Kour M, Soni I, Sharma R. Assessment of biofilm formation by Enterococcus faecalis causing nosocomial infections
and their statistical analysis. 2014;77–9.
6. Deteksi Biofilm dengan Tube Method dan
Congo Red Agar

 Christensen : Tube method

 Freeman : CRA

 Deteksi Polisakarida
Kerangka Teori
Kerangka Konsep

Uji Bakteri E. faecalis Uji Bakteri E. faecalis

menggunakan Congo Red Agar menggunakan Tube Method

Mendeteksi Biofilm pada bakteri E.

faecalis
Metode Penelitian
1. Desain penelitian :
 Deskriptif analitik

2. Tempat dan Waktu penelitian :

 Penelitian ini dilakukan di laboratorium riset Fakultas
Kedokteran Universitas Kristen Krida Wacana.
 Waktu penelitian akan dibagi menjadi empat waktu:
 Waktu pembuatan proposal dari Februari 2017 sampai Maret
2017.
 Waktu penatalaksanaan penelitian, pengambilan sampel, dan
pencatatan hasil dilakukan dari Maret 2017 sampai Oktober
2017.
 Waktu analisis hasil penelitian dan penulisan skripsi dari bulan
Maret 2017 sampai bulan Oktober 2017.
3. Subjek Penelitian
Tiga belas isolat bakteri Enterococcus faecalis
yang terkumpul dari hasil kultur kateter
urin periode Agustus- November 2016 di
rumah sakit swasta di Tangerang

4. Sampling
 Total sampling :
Tiga belas isolat bakteri Enterococcus faecalis
yang terkumpul dari hasil kultur kateter
urin periode Agustus - November 2016 di
rumah sakit swasta di Tangerang
 5. Bahan, alat, dan cara penelitian
 Tube Method (Devaraj, 2015)
I. 10 ml dari trypticase soy broth dengan glukosa 1% diinokulasi
dengan kumpulan mikroorganisme dari cawan yang dikultur
dalam jangka waktu semalam
II. Diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24-48 jam.
III. Tabung dituang dan dicuci dengan garam buffer fosfat (pH
7,3) dan dikeringkan.
IV. Tabung kering diwarnai dengan kristal ungu violet 0,1%.
Kelebihan noda dicuci dengan air deionisasi. Tabung
dikeringkan dalam posisi terbalik.
V. Skor untuk metode tabung dilakukan sesuai dengan hasil
strain kontrol. Pembentukan biofilm dianggap positif saat
film yang terlihat melapisi dinding dan bagian bawah tabung.
Jumlah biofilm yang terbentuk dinilai 1-lemah / tidak ada, 2-
sedang dan tinggi-3 / kuat, dibaca menggunakan
spektrofotometer.
VI. Percobaan dilakukan secara rangkap tiga dan diulang
sebanyak tiga kali.

• Devaraj C, Sajjan AG. Comparision of three different methods for the detection of biofilm in gram positive cocci
and gram negative bacilli isolated from clinical specimens. J Pharm Sci Res. 2015;7(11):952–5.
  Congo Red Agar (Deshpande, 2012)
I. Media CRA disiapkan dengan brain heart infusion broth 37 g
/ L, sukrosa 50 g / L, agar No. 1 (Oxoid, UK) 10 g / L dan
indikator Congo Red 8 g / L. Pewarna Red Congo disiapkan
sebagai solusi aquoeus terkonsentrasi
II. Diautoclav (121˚C selama 15 menit) secara terpisah dari
unsur penyusun media lainnya.
III. Kemudian ditambahkan ke medium agar yang telah
didinginkan sampai 55 ° C.
IV. Cawan diinokulasi dan diinkubasi secara aerobik selama 24-
48 jam pada suhu 37 ° C.
V. Hasil positif ditunjukkan oleh koloni hitam dengan
konsistensi kristal kering.
VI. Produsen biofilm lemah biasanya tetap merah muda, meski
kadang-kadang terjadi penggelapan di pusat koloni diamati.
Semakin gelap koloni, dengan tidak adanya morfologi
kolonial kristal kering, menunjukkan hasil yang tidak pasti.
VII. Percobaan dilakukan secara rangkap tiga dan diulang
sebanyak 3 kali.
• De A, Deshpande D, Baveja S, Taklikar S. Detection of biofilm formation in bacteria from cases of urinary tract
infections, septicemia, skin and soft tissue infections and post-operative infections by Congo Red Agar method. J
Acad Med Sci [Internet]. 2012
6. Parameter yang diperiksa :
Parameter yang diperiksa disini adalah angka
pertumbuhan biofilm bakteri Enterococcus
faecalis pada metode CRA dan metode
tube.
7. Dana Penelitian
Perkiraan Dana penelitian
 Trypticase Soy Broth : Rp. 300.000,00-
 Brain heart infusion : Rp. 955.000,00-
 Cawan petri x 30 : Rp. 90.000,00-
 Tabung reaksi x 30 : Rp. 90.000,00-
Total : Rp. 1.435.000,00-