Nella maggior parte dei casi non si può

isolare il gene a partire dalla proteina

 Clonaggio posizionale

Identificazione della sequenza di un gene a

partire dalla sua posizione fisica

Prima domanda: ci sono indicazioni

citogenetiche?
Clonaggio posizionale
Autosomal dominant trait

?
 Linkage analysis
• The mapping of a trait on the basis of its
tendency to be co-inherited with polymorphic
markers

Recombination
• The exchange (crossing over) of DNA
between members of a chromosomal pair,
usually in meiosis
 Recombination

gametes
 Basic rules of linkage
• Loci on different chromosomes will not be co-inherited
– i.e. locus A on chromosome 1 will not be co-inherited with
locus B on chromosome 2

• Loci on the same chromosome will be co-

inherited****

• The closer two loci are on the same chromosome the

greater the probability that they will be co-inherited
– i.e the likelihood of recombination is small
 CentiMorgan (cM)

• Thomas Hunt Morgan

• cM is the unit of genetic distance

– Loci 1cM apart have a 1% probability of
recombination during meiosis
– Loci 50cM apart are unlinked
 Practicalities of Linkage Analysis

Chrom. 1 Chrom. 2 Chrom. 3 etc

Determine the genotype of each family member

for polymorphic markers across the genome
 The genotype for a microsatellite
marker on chromosome 1
Paternal copy Maternal copy

6 (CA) allele * 8 (CA) allele *

The individuals genotype is (6 8)

Uninformative and informative meioses

66 66 66 68 68 68 68 9 10

66 66 66 68 68 68 89 6 10

Completely
Uninformative informative
 An autosomal
dominant
disease for which the
gene resides on
chromosome 1
Disease gene
But you don’t
know that! 1
Disease gene
Marker studied

Disease gene

56 47 23
Marker studied

Disease gene

23 15 44
Marker studied

Disease gene

15 35 67
Marker studied

Disease gene

24 25 27
Marker studied

Disease gene

13 12 45
Marker studied

Disease gene

24 25 27
 Genotype data for the whole family

(23) (16)

(14) (26) (34) (13) (58) (12

(1 ) (13) (78) (26) (47)

(24) (46) (33) (14) (18) (25) (18) (27) (46) (67) (24)
The next step - define the maximal region
of linkage

Gene resides
Disease gene
here
 Fibrosi cistica del pancreas

• Patologia autosomica recessiva, molto frequente

• Anomala viscosità delle secrezioni, che determina chiusura dei dotti
pancreatici (maldigestione) e dei bronchi (polmoniti recidivanti e
bronchiectasie).
• Anomala concentrazione di cloro nelle secrezioni (test del sudore)

Pancreas normale Pancreas di paziente

 Identificazione del gene della fibrosi cistica

• Nel 1985 il gene venne localizzato sul cromosoma 7 grazie al suo

linkage con un marcatore proteico.

• Successivamente fu possibile un mappaggio più fine, che localizzò

il gene in un intervallo di 500 kb tra due marcatori (cMet e D7S8).

• Il DNA di tutta la regione è stato clonato usando le tecniche del

chromosome walking e jumping.

• Il sequenziamento di questi cloni ha permesso di identificare nuovi

marcatori polimorfici, in forte linkage disequilibrium con il gene
della fibrosi cistica. Questo è stato possibile perché la maggior
parte degli alleli mutati nella popolazione non derivano da nuove
mutazioni, ma da un’unica mutazione ancestrale, mantenuta in virtù
del vantaggio dell’eterozigote (gli eterozigoti sono probabilmente
più resistenti del resto della popolazione all’infezione da Salmonella
typhi).
 Identificazione del gene della fibrosi cistica

Marcatore 1 Regione critica Marcatore 2

2 Mb

Gene malattia

Cloni YAC (1Mb)

Cloni BAC, P1, PAC (100-200 Kb)

Cloni fagici e cosmidici (20-40 Kb)

Identificazione del gene della fibrosi cistica
 Identificazione del gene della fibrosi cistica

• Il sequenziamento della regione fiancheggiante i marcatori più vicini

al gene della fibrosi cistica permise di identificare il primo esone del
gene.

• Il resto è stato identificato facendo diversi screening di cDNA

libraries.

• Alla fine nei pazienti è stata trovata nel 70% dei casi una mutazione
in omozigosi consistente nella delezione di un codone (F508Del).