MODELOS CENTRADOS

EN EL FACTOR
INDUCIBLE POR HIPOXIA
 INTRODUCCIÓN
1.- Aporte de oxígeno es esencial para a los tejidos
porque:
-es aceptor final de electrones en la
fosforilación oxidativa mitocondrial (fundamental
en para generar ATP)
- procesos enzimáticos (sustrato)

2.- Concentración celular de oxígeno controlada

(muerte celular por hipoxia).
Variaciones en el oxígeno genes.
 INTRODUCCIÓN

3.- Para el mantenimiento de la homeostasis se han

desarrollado unos mecanismos especializados para
la carga y distribución del oxígeno:
*estructuras especializadas: cuerpo carotídeo,
arterias pulmonares, cuerpos neuroepiteliales
*órganos altamente complejos: pulmón,
sangre, sistema cardiovascular.
PROCESOS FISIOPATOLÓGICOS REGULADOS POR HIPOXIA

HIPOXIA SISTEMICA HIPOXIA LOCAL

DISMINUCIÓN DEL PÉRDIDA DE
NIVEL DE OXÍGENO VASCULARIZACIÓN
EN LA SANGRE Y EN EN TEJIDOS
LOS TEJIDOS
•Desarrollo embrionario
•Altitud elevada
•Tumores sólidos (áreas perinecróticas)
•Enfermedades pulmonares
crónicas •Isquemia (cerebral, miocárdica, etc)
•Anemias
•Hemorragias

•Inducción de eritropoyetina
(Riñón)
Aumento de eritrocitos
en sangre
•Inducción de tirosina hidroxilasa
y dopamina (Cuerpo carotídeo)
Aumento de la frecuencia
respiratoria
O2
•Angiogénesis
Inducción de VEGF, Flt-1, PAI-1
•Metabolismo de la glucosa
(hipoxia celular)
Inducción de la ruta glicolítica
 Crecimiento y Apoptosis
IGF-binding protein1,2,3
Nip3
Metabolismo Energético Gen Supresor de Wilms
Transportadores de glucosa 1 y 3 a-Fetoproteina (regulación negativa)
Hexokinasa-2 Receptor homólogo de calcitonina
6-fosfofructokinasa-1 L IGF-2
Gliceraldehido -3- fosfato Ciclina G2 Migración celular
deshidrogenasa y metástasis
AldolasaA CXCR4
Fosfogliceratokinasa-1 c-Met
6-fosfofructo-2-kinasa
Anhidrasa carbónica 9 Regulación transcripcional
Enolasa-1 DEC-1 & DEC-2
Lactato deshidrogenasa A ETS-1
HIF p35srj

Metabolismo del hierro Angiogénesis y Tono vascular

y Eritropoyesis VEGF
Eritropoyetina Flt-1
Transferrina PAI-1
Receptor de transferrina Endoglina
Ceruloplasmina Endotelina-1
Adrenomedulina
Tirosina hidroxilasa
Otros Receptor adrenérgico 1
Colágeno de tipo V, 1 Óxido nítrico sintasa inducible
p21 Óxido nítrico sintasa endotelial
Prolil-4-hidroxilasa  de procolágeno Hemo oxigenasa
Prolil-hidroxilasas PHD1 y PHD3 Péptido natriurético del atrio
VEGF derivado de glándula endocrina
TGF-3
PHD=HIF Prolil-Hidroxilasas

2OG O2 CO2 Succinato

Fe+2
Pro OH-Pro HIF1
HIF1 Degradación
Proteosoma
VHL
HIF1

Ubiquitinaciòn
HIF1

ARNT

VEGF
EPO Angiogenesis
A


LDH Control respiratorio

F1
RN

Metabol.anaerobico
HI
T

HIF Response Element

 SISTEMAS DE HIPOXIA
In vitro
- células incubadas en atmósfera a porcentaje de
oxígeno. El porcentaje fisiológico (normoxia) es de 20%.
La hipoxia se considera a porcentajes inferiores al 5%.

In vitro
- hipoxia química: empleo de quelantes de hierro
como la desferroxamina o el cloruro de cobalto
 SISTEMAS DE HIPOXIA

In vivo
- tratamiento con cloruro de cobalto en la dieta
de los animales
- animales expuestos en cámaras a bajas
concentraciones de oxígeno
- inducción de isquemia: cerrando la arteria
renal.
 ACTIVIDAD
TRANSCRIPCIONAL
 ACTIVIDAD
TRANSCRIPCIONAL
 ENSAYO DE UNIÓN A DNA
EMSA
EMSA: “electrophoretic mobility shift assay

Aplicaciones: detección de uniones DNA-proteínas.

Fundamental para factores de transcripción.

Fundamento: Los complejos de DNA-proteína migran

más despación en el gel que los fragmentos de DNA
libres
 ENSAYO DE UNIÓN A DNA EMSA
Procedimiento:
1.- Extracción de proteínas nucleares
- Lisis buffer con NP-40
- Lavados (pellet=núcleo; sbte=citoplasma
- Adición de buffer hipotínico: el núcleo se hincha
- Adción de buffer con alto contenido en sales: se
extraen las proteínas nucleares y permanece intacto el
DNA.

2.- Preparación del oligonucleótido con la secuencia de

interés específica:
- Alineamiento
- Marcaje con 32P (random primer)
 ENSAYO DE UNIÓN A DNA EMSA
3.- EMSA
- Incubación de los extractos nucleares con el
oligonucleótido marcado ([sales], pH…)
- Separación de los complejos formados en gel
de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes
- Detección por autorradiografía
- Controles internos:
*control positivo
*control especificidad de la unión (Exceso
de oligo frío, oligo diferente que no contenga la
secuencia de interés
- supershift: permite determinar que subunidad
del factor de transcripción es la responsable de “Shift”.
Se usan anticuerpos específicos que dicha unidad. El
complejo formado migrará aún menos que el complejo
DNA-proteína.
ENSAYO DE UNIÓN A DNA EMSA
    1     2    3    4
Lane
EBNA Extract      -     +    +    + 

Unlabeled EBNA DNA      -      -    +     - 

Unlabeled Oct-1 DNA      -      -     -    + 

                             
 INMUNOHISTOQUÍMICA
Aplicaciones: determinar la localización de proteínas en
un tejido.

Fundamento: Técnica basada en la capacidad de los

anticuerpos de unirse a sus correspondientes
antígenos.

Variantes:
1.- Inmunofluorescencia. Evidencia antígenos
tisulares/celuares mediante anticuerpos marcados con
una sustancia fluorescente. El anticuerpo primario
puede estar directamente conjugado por ejemplo con
fluoresceína (directa) o el anticuerpo secundario
(indirecta). Se emplea en el estudio de biopsias renales
o cutáneas.
 INMUNOHISTOQUÍMICA
Variantes:
1.- Inmunofluorescencia. Evidencia antígenos
tisulares/celuares mediante anticuerpos marcados con
una sustancia fluorescente. El anticuerpo primario
puede estar directamente conjugado por ejemplo con
fluoresceína (directa) o el anticuerpo secundario
(indirecta). Se emplea en el estudio de biopsias renales
o cutáneas.
2.- Inmunohistoquímica: la reacción antigeno-
anticuerpo se visualiza añadiendo al anticuerpo una
enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) que se une a
un cromógeno que será visualizado en luz visible. Se
puede ampliar la señal con compljos biotina
estreptavidina.
 INMUNOHISTOQUÍMICA

ANTICUERPOS
Monoclonales: todos los anticuerpos producidos
reconocen el mismo epítopo (zona variable),
producidos por hibridomas (células B del bazo +
células de mieloma inmortales) generalmente en
ratones

Policlonales: mezcla de anticuerpos para más de

un epítopo. Generalmente extraídos del suero de
conejos inmunizados con el antígeno.
 INMUNOHISTOQUÍMICA
UTILIDAD
La prinicipal utilidad de esta técnica está en la
posibilidad que nos ofrece para identificar:
- proteínas de estirpes celulares (neuronas,
epitelio, endotelio…);
- sustancias diversas o agentes infecciosos
(bacterias, virus);
- clasificar tumores indiferenciados, leucemias,
linfomas,
- precisar el origen de tumores metastásicos y
detectar moléculas con significado pronóstico o
terapéutico,
- estudiar los estados de proliferación (con
análogos nucleótidos)
 INMUNOHISTOQUÍMICA

CONTROLES
- como control negativo realizar en paralelo, con
una muestra equivalente a la problema al proceso
exactamente igual pero excluyendo el anicuerpo
primario o incluyendo la inmunoglobulina empleada
para producir el anticuerpo primario pero carente de la
zona específica (zona variable).
- como control positivo emplear un anticuerpo de
expresión conocida y ensayado con anterioridad
INMUNOHISTOQUÍMICA

Corte de cerebro de pejerrey (Odontesthes

bonariensis). Inmunofluorescencia.
Neuropéptido Y.
INMUNOHISTOQUÍMICA

Linfoma Maligno no Hodgkin

Inmunoblático de Células
Grandes, compresión de
túbulos y glomérulos. PMx40