Professional Documents
Culture Documents
Inhibicin por el sustrato. De acuerdo a la ecuacin de Michaelis-Menten, con el aumento de la concentracin del sustrato la V0 de la reaccin fermentativa hiperblicamente crece, teniendo a alcanzar su significado lmite. Sin embargo, pero en una serie de casos con el aumento de la concentracin del sustrato la V0 inicial de reaccin enzimtico pasa por un mximo (esto es lo que no se somete a la ecuacin de Michaelis-Menten) y posteriormente disminuye como el caso de la fig. 88. Esquemticamente, este proceso de la inhibicin se puede representar de la siguiente forma:
E Sn p ES p E P
Ks K CAT
El anlisis de este esquema y las condiciones de equilibrio establecidas, ms la condicin [S]0>>[E]0 nos lleva a la siguiente ecuacin para la V0 de la
SES p P E
Este complejo no posee Actividad
Esta ecuacin se puede analizar para dos casos: 1. Caso: A muy bajas concentraciones de sustrato donde:
2 ?S A0 ! S
Lg[S]0 Fig. 88. Inhibicin por el sustrato en la Reaccin de transmetilacin Catalizada por feniletenolamin-NMetiltransferasa (37)
?S A0
V0 !
reaccin enzimtica
[ ]0 [ S ]0 2 [ S ]0 [ S ]0 '
S
Primer caso
2 ?S A0 K S!
K CAT [ E ]0 [ S ]0 2 [ S ]0 K S [ S ]0 ' KS
Segundo caso
V0 !
[ ]0 [ S ] 0 [ S ]0 S
El significado de KCAT y Ks se pueden obtener si acomodamos los datos experimentales en las coordenadas de linea weaver - Burk . Esto es a bajas concentraciones de sustrato
1 KS
Si los resultados obtenidos de KCAT para ambos casos, [S]0 << KS' y [S]0 >> KS, son los mismos, esto es una demostracin, que el esquema del mecanismo modelo propuesto para este tipo de inhibicin es aceptable para la descripcin formal de la cintica de la reaccin enzimtica estudiada
K CAT [ E ]0 V0 ! [ S ]0 1 ' KS
[ S ]0 ""
1 v
K cat
Vmax ! ?E A0
Ks Vmax
?E A0
v
TangE !
1 V max
1 ?S A0
! S
1 K cat
?S A0 MM
v ?EA0
Para encontrar si el complejo terciario SES posee o no posee actividad, es necesario construir de los datos experimentales la grfica (V, lg [S]0). Si la campana obtenida tiene forma simtrica, esto indica la ausencia de la actividad del complejo SES, por lo tanto F = 0. Si la parte derecha de la grfica, a altas concentraciones de sustrato es menos pronunciada con menos pendiente, es decir que rompe la simetra de la campana en comparacin con la parte izquierda de esta, (fig. 90), esto nos indica que la magnitud F es diferente de cero (0< F <1). Por lo tanto el complejo SES tiene actividad y da lugar a la formacin de producto
E Sn p ES p E P
s CAT
SES p P E
Este complejo no posee Actividad
Kcat
lg? A S0
(0< F <1).
Ahora para determinar en el experimento si el complejo SES tiene actividad enzimtico y para producir producto pero mucho menos que el complejo [ES] por lo tanto (F<1).
Bajo la condicin de [S]0 >> E y los equilibrios establecidos, la velocidad inicial de la reaccin enzimtica, para este esquema, se describe por la ecuacin de V0 igual a Para un anlisis de este caso la ecuacin de la velocidad, a altas concentraciones de sustrato es mejor escribirla de la forma siguiente, haciendo la consideracin:
E S np ES p E P
S CAT
SES FKp SE P
CAT
K ef !
Vmax [E ]0
1 1 F
1
1 K ef K cat
K S' 1 1 1 ! y K ef 1 F 1 F [ S ]0 1 K CAT
Tang
! KS ! (1 F )
F debe de
F > 0, pero < que 1
1 , M 1 ?S A
Existen formas de inhibicin, que se observan a altas concentraciones de sustrato cuando en el resultado de unin entre la enzima y el sustrato se adhieren algunas molculas de sustrato originando con esto la inactivacin. Esto se aprecia en la forma no simtrica de la curva en las coordenadas (V, lg [S]0), de la parte derecha que corresponde a concentracin ms alta de sustrato (fig. 92). Para el anlisis de estos casos se ha elaborado un mtodo grfico en el trabajo (9), que permite determinar el nmero de molculas de sustrato que se encuentran en el complejo SE en su forma inactiva esquema (6.90).
K E S np ES Kp E P
S CAT
V, m M * se g1
nS
KS'
[SA0 Ig [SA0
- 3.0 - 2.5
- 2.0
ES n + 1
- 1.5
Supongamos que la unin de molculas adicionales con el complejo SE, se efecta independientemente de uno y de otro y que la unin de n molculas adicionales de sustrato se caracterizan por constantes iguales de equilibrio
6.91
v!
Vmax [ S ]0 n [ S ]0 1 K S [ S ]0 ' KS
[ S ]OPT .
K S K S' ! n1 n
KS'.
En este caso la ecuacin para la velocidad inicial de la reaccin enzimtica que se efecta en un rgimen de equilibrio establecido y la condicin de [S]>>[E]0 tiene la siguiente forma:
Diferenciando la ecuacin (6.91) de acuerdo a la concentracin inicial de sustrato y igualando la expresin obtenida a cero, obtenemos la correlacin que une la magnitud de la concentracin ptima de sustrato (que corresponde al mximo de la curva en las coordenadas V, lg [S]) con los parmetros del esquema (6.90):
Vmax [ S ]0 v! n [ S ]0 1 K S [ S ]0 ' KS
n [ S ]0 1 V 1 1 ! y ' [ S ]0 K S K S K S v K S
KS 1 1 [S ] ! v V [ S ]0 V VK
n 0 ' S
[ S ]OPT .
K S K S' ! n 1 n
Encontrando con la ayuda de la grfica en la coordenadas (V, lg [S]0) y la correlacin (6.92), para obtener el significado de (n) de la serie de productos de la multiplicacin KS Ks', las cules corresponden a diferente significados de n y analizando los datos experimentales
n=1
2.0
n=2
?S A0 , mM 1 1 ?SA0 KS KS'
n
n=3
n=4
20
40
60
1 v
E S np ES p E P
KS K cat
Es importante considerar, que bajo la condicin de F > 1 (esquema 6.95) los datos cinticos correspondientes a altas concentraciones de sustrato, es mejor analizarlos en las coordenadas de
SES p SE P
1 K efct K cat
1
FK cat
1 ; ?S A0
K Efect 1 K cat
1
0.8
0.6
' KS tgN ! F 1
0.4
0.2
1 K efect K cat 1
! KS 1 1 ! y F 1 F 1 ?S A0
1 F 1
20 40 60 80 100
Anlisis cintico (39), de la activacin por el sustrato, en la reaccin de hidrlisis de p nitro anailida L- lisina, catlizada por tripsina, en las coordenadas de la ecuacin 6.96
ISOMERIZACIN DE LA ENZIMA EN EL TRANSCURSO DE LA REACCIN Otra desviacin de la ecuacin de Michaelis y Menten es condicionada tambin porque la enzima puede dar el caso que en forma irreversible puede isomerizarse con la formacin de una coenzima inactiva (E*):
ESn p ES p E P E np E *
V ?S Ao y K s ?S Ao 1 1
k eq
kS
k2
?S Ao
Ks K eq
v!
v!
?S Ao
Ks
El substrato forma el complejo con la enzima, aunque parcialmente obstaculiza el proceso de isomerizacin. Veamos el caso del esquema 6.97, cuando la isomerizacin en la enzima con el substrato prcticamente no se da. La velocidad inicial de la reaccin enzimtica del esquema 6.97 en condiciones de equilibrio establecidas y la [So] "" [Eo], se expresa con la siguiente ecuacin.
A altas concentraciones de [S] A bajas concentraciones de [S]
Donde V = K2 [E]o. A altas concentraciones de substrato cuando se cumple la desigualdad 1+ [S]o/Ks "" Keq la ecuacin 6.98 se simplifica y toma la forma de una ecuacin de Michaelis y Menten. En la regin de bajas concentraciones de substrato ([S]o Ks) entonces la velocidad de la reaccin enzimtica en forma lineal depende de la concentracin inicial del substrato [S]o
V ?S Ao 1 y .......... .......(6.99) 1 K eq Ks
K 1 ! K eq s ..................( 6.100) 1 v V ?S Ao
v
V Tang E ! K equi
K S 1
1 v
TangE !
K
K 1
Equi
?S A0
1 ?S A0