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ANLISIS CINTICO DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS QUE NO SE SOMETEN A LA ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN

Inhibicin por el sustrato. De acuerdo a la ecuacin de Michaelis-Menten, con el aumento de la concentracin del sustrato la V0 de la reaccin fermentativa hiperblicamente crece, teniendo a alcanzar su significado lmite. Sin embargo, pero en una serie de casos con el aumento de la concentracin del sustrato la V0 inicial de reaccin enzimtico pasa por un mximo (esto es lo que no se somete a la ecuacin de Michaelis-Menten) y posteriormente disminuye como el caso de la fig. 88. Esquemticamente, este proceso de la inhibicin se puede representar de la siguiente forma:

E  Sn p ES p E  P
Ks K CAT

El anlisis de este esquema y las condiciones de equilibrio establecidas, ms la condicin [S]0>>[E]0 nos lleva a la siguiente ecuacin para la V0 de la

SES p P  E
Este complejo no posee Actividad

Esta ecuacin se puede analizar para dos casos: 1. Caso: A muy bajas concentraciones de sustrato donde:
2 ?S A0 ! S

Lg[S]0 Fig. 88. Inhibicin por el sustrato en la Reaccin de transmetilacin Catalizada por feniletenolamin-NMetiltransferasa (37)

2, caso: Y a altas concentraciones de sustrato donde:

?S A0

V0 !

reaccin enzimtica

[ ]0 [ S ]0 2 [ S ]0  [ S ]0  '
S

Primer caso la ecuacin:


donde:
2 ?S A0 K S!
0

A muy bajas concentraciones de sustrato


Ecuacin 6.83
Segundo caso, se divide ente [S]0

Primer caso

2 ?S A0 K S!

K CAT [ E ]0 [ S ]0 2 [ S ]0 K S  [ S ]0  ' KS
Segundo caso

V0 !

[ ]0 [ S ] 0  [ S ]0 S

Segundo caso, a altas concentraciones de sustrato

El significado de KCAT y Ks se pueden obtener si acomodamos los datos experimentales en las coordenadas de linea weaver - Burk . Esto es a bajas concentraciones de sustrato

1 KS

Si los resultados obtenidos de KCAT para ambos casos, [S]0 << KS' y [S]0 >> KS, son los mismos, esto es una demostracin, que el esquema del mecanismo modelo propuesto para este tipo de inhibicin es aceptable para la descripcin formal de la cintica de la reaccin enzimtica estudiada

K CAT [ E ]0 V0 ! [ S ]0 1 ' KS

[ S ]0 ""

1 v

K cat

Vmax ! ?E A0
Ks Vmax

?E A0
v

1 1 [ S ]0 !!  ' V0 K CAT [ E ]0 ' K S K CAT [ E ]0

TangE !

1 V max
1 ?S A0

! S

1 K cat

Recordar que el anlisis se hace a altas concertaciones de sustrato

Fig. 89. determinacin de la constante de disociacin del complejo inactivo SES.

?S A0 MM

v ?EA0

Para encontrar si el complejo terciario SES posee o no posee actividad, es necesario construir de los datos experimentales la grfica (V, lg [S]0). Si la campana obtenida tiene forma simtrica, esto indica la ausencia de la actividad del complejo SES, por lo tanto F = 0. Si la parte derecha de la grfica, a altas concentraciones de sustrato es menos pronunciada con menos pendiente, es decir que rompe la simetra de la campana en comparacin con la parte izquierda de esta, (fig. 90), esto nos indica que la magnitud F es diferente de cero (0< F <1). Por lo tanto el complejo SES tiene actividad y da lugar a la formacin de producto

E  Sn p ES p E  P
s CAT

SES p P  E
Este complejo no posee Actividad

Kcat

Fig.90. Inhibicin por sustrato, en la reaccin bezilpeicilina, catalizada por peniciliacidasa

lg? A S0

(0< F <1).

Ahora para determinar en el experimento si el complejo SES tiene actividad enzimtico y para producir producto pero mucho menos que el complejo [ES] por lo tanto (F<1).
Bajo la condicin de [S]0 >> E y los equilibrios establecidos, la velocidad inicial de la reaccin enzimtica, para este esquema, se describe por la ecuacin de V0 igual a Para un anlisis de este caso la ecuacin de la velocidad, a altas concentraciones de sustrato es mejor escribirla de la forma siguiente, haciendo la consideracin:

E  S np ES p E  P
S CAT

SES FKp SE  P
CAT

F K CAT ?S A0 K CAT  [ E ]0 [ S ]0 d KS V0 ! [ S ]2 Recordar que el anlisis se hace K S  [ S ]0  ' 0 a altas concertaciones de KS


sustrato

K ef !

Vmax [E ]0

1 1 F

F [ S ]0 1 K S' K ef ! K CAT [ S ]0 1 ' KS

1

1 K ef K cat

K S' 1 1 1 !  y K ef 1  F 1  F [ S ]0 1 K CAT
Tang
! KS ! (1  F )

F  debe  de
F > 0, pero < que 1

1 , M 1 ?S A

Existen formas de inhibicin, que se observan a altas concentraciones de sustrato cuando en el resultado de unin entre la enzima y el sustrato se adhieren algunas molculas de sustrato originando con esto la inactivacin. Esto se aprecia en la forma no simtrica de la curva en las coordenadas (V, lg [S]0), de la parte derecha que corresponde a concentracin ms alta de sustrato (fig. 92). Para el anlisis de estos casos se ha elaborado un mtodo grfico en el trabajo (9), que permite determinar el nmero de molculas de sustrato que se encuentran en el complejo SE en su forma inactiva esquema (6.90).

K E  S np ES Kp E  P
S CAT

V, m M * se g1

0.04 0.03 0.02 0.01

nS

KS'

[SA0 Ig [SA0
- 3.0 - 2.5
- 2.0

ES n + 1
- 1.5

Supongamos que la unin de molculas adicionales con el complejo SE, se efecta independientemente de uno y de otro y que la unin de n molculas adicionales de sustrato se caracterizan por constantes iguales de equilibrio

6.91
v!

Vmax [ S ]0 n [ S ]0 1 K S  [ S ]0  ' KS

[ S ]OPT .

K S K S' ! n1 n

KS'.
En este caso la ecuacin para la velocidad inicial de la reaccin enzimtica que se efecta en un rgimen de equilibrio establecido y la condicin de [S]>>[E]0 tiene la siguiente forma:

Diferenciando la ecuacin (6.91) de acuerdo a la concentracin inicial de sustrato y igualando la expresin obtenida a cero, obtenemos la correlacin que une la magnitud de la concentracin ptima de sustrato (que corresponde al mximo de la curva en las coordenadas V, lg [S]) con los parmetros del esquema (6.90):

despejando de aqu n, encontramos el nmero de molculas de [S] unidas al complejo ES.

Vmax [ S ]0 v! n [ S ]0 1 K S  [ S ]0  ' KS
n [ S ]0 1 V 1 1  ! y  ' [ S ]0 K S K S K S v K S

KS 1 1 [S ] !   v V [ S ]0 V VK

n 0 ' S

[ S ]OPT .

K S K S' ! n 1 n

Encontrando con la ayuda de la grfica en la coordenadas (V, lg [S]0) y la correlacin (6.92), para obtener el significado de (n) de la serie de productos de la multiplicacin KS Ks', las cules corresponden a diferente significados de n y analizando los datos experimentales

Manejando el eje de coordenadas


n 1 [ S ]0 1 [S ]  K K ' , v S S 0

n=1
2.0

n=2

?S A0 , mM 1 1  ?SA0 KS KS'
n

1.5 1.0 0.5

n=3

2.0 1.5 1.0 0.5

n=4

20

40

60

1 v

ACTIVACIN POR EL SUSTRATO


En una serie de casos, con el aumento de la concentracin del sustrato, la velocidad de la reaccin enzimtica, excede la velocidad mxima terica (V), lo cual ha sido calculado de datos utilizados con concentraciones no muy altas. Una forma sencilla de interpretar este fenmeno es mediante el esquema siguiente con la condicin de F > 1. El anlisis de los datos experimentales en caso de activacin por el sustrato, se efecta de la misma manera, como en el anlisis de la reaccin de inhibicin de la enzima por el sustrato, ver (6.86) (6.88). Es importante considerar, que bajo la condicin de F > 1

E  S np ES p E  P
KS K cat
Es importante considerar, que bajo la condicin de F > 1 (esquema 6.95) los datos cinticos correspondientes a altas concentraciones de sustrato, es mejor analizarlos en las coordenadas de

SES p SE  P
1 K efct K cat
1

FK cat

1 ; ?S A0

K Efect  1 K cat

1
0.8

0.6

' KS tgN ! F 1

0.4

0.2

1 K efect K cat 1

! KS 1 1 !  y F  1 F  1 ?S A0

1 F 1
20 40 60 80 100

Anlisis cintico (39), de la activacin por el sustrato, en la reaccin de hidrlisis de p nitro anailida L- lisina, catlizada por tripsina, en las coordenadas de la ecuacin 6.96

ISOMERIZACIN DE LA ENZIMA EN EL TRANSCURSO DE LA REACCIN Otra desviacin de la ecuacin de Michaelis y Menten es condicionada tambin porque la enzima puede dar el caso que en forma irreversible puede isomerizarse con la formacin de una coenzima inactiva (E*):

ESn p ES p E  P E np E *
V ?S Ao y K s  ?S Ao 1 1
k eq

kS

k2

?S Ao
Ks  K eq
v!

v!

?S Ao
Ks

El substrato forma el complejo con la enzima, aunque parcialmente obstaculiza el proceso de isomerizacin. Veamos el caso del esquema 6.97, cuando la isomerizacin en la enzima con el substrato prcticamente no se da. La velocidad inicial de la reaccin enzimtica del esquema 6.97 en condiciones de equilibrio establecidas y la [So] "" [Eo], se expresa con la siguiente ecuacin.
A altas concentraciones de [S] A bajas concentraciones de [S]

Donde V = K2 [E]o. A altas concentraciones de substrato cuando se cumple la desigualdad 1+ [S]o/Ks "" Keq la ecuacin 6.98 se simplifica y toma la forma de una ecuacin de Michaelis y Menten. En la regin de bajas concentraciones de substrato ([S]o Ks) entonces la velocidad de la reaccin enzimtica en forma lineal depende de la concentracin inicial del substrato [S]o

V ?S Ao 1 y .......... .......(6.99) 1  K eq Ks

K 1 !  K eq s ..................( 6.100) 1 v V ?S Ao

v
V Tang E !  K equi K S 1

1 v

TangE !

 K K 1
Equi

?S A0

1 ?S A0

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