Turma: 4o Cincias Biolgicas Biologia Molecular

Seqenciamento de DNA

Prof. Msc. Raphael Augusto

Introduo
O seqenciamento de DNA um processo que determina a ordem dos nucleotdeos (blocos que constituem a molcula de DNA) em uma amostra.

Introduo
O processo realizado a partir de uma cadeia simples (no dupla) do DNA a ser seqenciado;

Essa servir de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hlice.

Desnaturao da molcula nativa

*A Formamida causa a separao da dupla hlice.

Reao de sntese
Deve permanecer em condies inicas e de pH apropriadas; Na presena da enzima DNA polimerase; Uma mistura dos 4 nucleotdeos sob a forma de 3-desoxinucleotdeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e dTTP;

 O mais utilizado o dATP P, figura 2a.

 necessrio tambm, a presena na reao, de um pequeno fragmento de DNA sinttico (XXX) complementar a uma regio conhecida (YYY) na extremidade 3 do DNA molde; (Primers) o iniciador; utilizado para rastrear o fragmento recm-sintetizado;

 Fato importante no processo que ele executado em quatro reaes separadas;

cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de anlogo, 2, 3-didesoxinucleotdeo trifosfatos (ddNTPs) (fig 2b).

Mtodo
O mais utilizado o chamado mtodo didesoxi conhecido tambm como de terminadores de cadeia ou de Sanger; ele constitui a base da metodologia empregada no seqenciamento do genoma humano.

Mtodo
Consiste em identificar, continuamente e seqencialmente durante o processo, o ltimo nucleotdeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia.

Mtodo
Os produtos da reao devero tambm portar uma marca que permita detectlos na etapa de anlise. Marcador contendo Fsforo radioativo (P32).

Mtodo
Os anlogos de nucleotdeos, conhecidos como terminadores quando incorporados cadeia nascente, por no apresentarem 3OH que permita formar ligao com o prximo dNTP a ser adicionado, bloquear todo processo.

 Como todos os nucleotdeos normais (dNTPs) esto presentes, o alongamento da cadeia prosseguir at que a enzima DNA-polimerase insira um anlogo (ddNTP). Haver parada apenas no ponto onde foi interrompido;

Anlise da reao
so separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente: um canal de anlise para cada reao. O gel transferido para um suporte de nitrocelulose(filtro).

Anlise
na cadeia de DNA recm sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta complementar da molcula sequenciada: que serviu de molde. possvel conhecer a sequncia de nucleotdeos do DNA sequenciado de 3para 5 partindo-se da parte inferior para a superior do gel.

Resultado
Atravs de maquinaria apropriada gerenciada por computadores com softs que lem seqencialmente e identificam os produtos. Neste caso utilizam-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotdeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescncia

Softs apropriado para anlise automtica

 Como cada reao (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um nico canal do gel de seqenciamento (figura 4b)

 O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, aps iluminao com um feixe de laser, identificar os produtos baseado na diferena de comprimento de onda. A luz emitida detectada por escaneamento do gel e a seqncia deduzida por computador (figura 4c).

Servio de Seqenciamento de DNA no IQUSP (SSDNA)

Aplicao dos terminadores de cadeia

So utilizados no combate AIDS e Herpesvrus. A droga deve sobreviver no corpo e ser absorvida pelas clulas apropriadas. A dideoxicitosina ddC; Esse processo pode afetar a replicao do DNA das clulas humanas normais, no entanto a transcriptase reversa mais sensvel;

Concluindo o processo de seqenciamento Durante o mtodo de seqenciamento, o genoma no lido de uma vez s, ele , na verdade estilhaado em milhares de fragmentos. Esses fragmentos so lidos por equipamentos de seqenciamento e digitalizados em computadores.

 O segundo passo, consiste em regerar a seqncia genmica completa, a partir dos fragmentos lidos.

Esse processo conhecido como montagem do genoma, e depende de programas.

Objetivo
Projeto genoma Humano.

Genoma
Conjunto de genes de um organismo, patrimnio gentico armazenado na coleo de genes que fica alojada nos cromossomos, localizados no ncleo da clula.

Funo do Genoma
Armazenar informaes sobre as principais caractersticas hereditrias, alteraes e doenas que podem surgir ao longo da vida.

Importncia
Conhecendo e localizando os genes determinante para predizer se uma pessoa ir ou no desenvolver um nmero expressivo de doenas. Para consertar os erros genticos e desenvolver drogas de ao mais especfica surgiu o PGH (projeto genoma humano).

PGH (Projeto Genoma Humano) Empreendimento internacional, iniciado formalmente em 1990 e projetado pra durar 15 anos, com os seguintes objetivos:

Objetivos do PGH
Identificar e fazer o mapeamento dos cerca de 80mil genes que se calculava existir no DNA das clulas do corpo humano; Determinar as sequencias dos 3 bilhes de bases qumicas que compem o DNA humano; Armazenar essa informao em bancos de dados, desenvolver ferramentas eficientes para analisar esses dados e torn-los acessveis para novas pesquisas biolgicas;

O objetivo do PGH
Construir uma srie de diagramas descritivos de cada cromossomo humano, com resolues cada vez mais apuradas.

 Assim necessrio dividir os cromossomos em fragmentos menores que possam ser propagados e caracterizados e depois ordenar estes fragmentos, de forma a corresponderem a suas respectivas posies nos cromossomos.

 Aps o mapeamento:
Determinar a seqncia das bases de cada um dos fragmentos de DNA j ordenados. Com o objetivo de descobrir todos os genes na seqncia do DNA e desenvolver meios de usar esta informao para estudos da biologia e medicina.

Mapa genmico
Descreve a ordem dos genes ou de outros marcadores e o espaamento entre eles, em cada cromossomo. Mapas de baixa resoluo: indicam as posies relativas dos marcadores; Mapas fsicos: descrevem caractersticas qumicas da prpria molcula de DNA.

Benefcios do PGH
Fator gentico; Terapia gnica; Biotecnologia;

220 Kd -

CD 201

50 Kd -

CD 216

10 Kd -

PM

10

11 12

13

14 15

Figura 1. Gel SDS-PAGE de diferentes sementes de soja corado com prata. As amostras 2, 3, 14 e 15 so da cv. Antaro, 1, 12 e 13 so CD216, 10 e 11 so BRS 48, 8 e 9 so CD 201, 6 e 7 so CD 208 e 4 e 5 so Vmax singenta. PM o padro de peso molecular.

A colorao de comassie blue revelou 35 a 40 seqncias polipeptdicas, sendo oito polimrficas.

1-

1 2

3 4

5 6

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Figura 01. Gel de poliacrilamida de protena total corado com comassie Figura blue, de 1poliacrilamida de protena total RR, 6 a 10 comassie blue, 1 a 5 2. Gel de a 5 amostras da cv. CD 219 corado com amostras da amostras da cv.214 RR, e 11 a 20 amostrasda cv. CD 214RR, e 11 direita cv. CD CD 219RR, 6 a 10 amostras da cv. CD 213 RR. A a 20 amostras da cv. CD 213RR. A direita do gel, esto indicadas as 2 regies polimrficas. do gel, esto indicadas as 2 regies polimrficas.

 Fim