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Virologa Laboratorio Bacteriologia V Semestre

Las tcnicas inmunolgicas se utilizan para detectar, identificar y cuantificar antgenos en muestras clnicas, as como para evaluar la respuesta humoral frente a la infeccin y los antecedentes de exposicin a agentes infecciosos de un individuo.
Dado que el diseo de un gran nmero pruebas serolgicas pretende obtener resultado positivo o negativo, cuantificacin de la potencia de anticuerpo se obtiene en forma de ttulo. de un la un

Anticuerpos Son protenas, llamadas tambin inmunoglobulinas (Ig), producidas por las clulas plasmticas derivados de los LsB y capaces de reaccionar con un Ag.

ANTICUERPOS MONOCLONALES Son aquellos anticuerpos capaces reconocer epitopos individuales de antigeno.

de un

ANTICUERPOS POLICLONALES Los anticuerpos policlonales son una mezcla de inmunoglobulina, secretados en contra de un antgeno especfico, cada una reconociendo diferentes epitopos.

Las ventajas de los anticuerpos monoclonales radican en la posibilidad de restringir su especificidad a un nico eptopo antignico y de preparacin en cultivos tisulares. Una importante desventaja de los anticuerpos monoclonales se debe a su excesiva especificidad, de manera que es posible que un anticuerpo monoclonal especfico para un eptopo de un antgeno vrico de una cepa no sea capaz de detectar cepas diferentes de ese mismo virus.

METODOS DE DETECCION Los complejos Ag-Ac se pueden detectar directamente por tcnicas de precipitacin o marcando el anticuerpo con una sonda radiactiva, fluorescente o enzimtica, o indirectamente por la medicin de una reaccin frente al anticuerpo, como la fijacin del complemento.

METODOS DE DETECCION Tcnicas de precipitacin e inmunodifusin


La

inmunodifusin radial simple Inmunodifusin doble de Ouchterlony

En esta tcnica, el antgeno se coloca en un pocillo y se permite que difunda en un agar que contenga anticuerpo. Cuanto mayor sea la concentracin del antgeno, ms lejos difundir hasta alcanzar la equivalencia con el anticuerpo en el agar y precipitar en forma de anillo alrededor del pocillo.

En esta tcnica se colocan soluciones de Ag y Ac en pocillos separados abiertos en agar y se permite que difundan uno hacia el otro para establecer los gradientes de concentracin de cada sustancia. Esta tcnica tambin se emplea para determinar si las muestras son idnticas, si comparten algun patron, o bien si se trata de muestras diferentes. Esta tcnica se usa para detectar anticuerpos de antgenos micticos (p. ej., especies de Histoplasma, especies de Blastomyces, coccidioidomicosis).

En la inmunofluorescencia directa los antigenos virales presentes en las celulas del paciente o de un cultivo celular son detectados con el uso de un Ac especifico contra el virus marcado con un colorante fluorescente, que generalmente es isotiocianato de fluorescena.

En la deteccin de Ac sricos se necesita tener un sustrato en el cual hacer la reaccin. Luego se agrega suero del paciente, se lava y se agrega un anti-anticuerpo humano marcado con FITC que se pegara al anticuerpo que reacciono ( si los hay). Si el suero del paciente tenia Ac contra el virus evaluado la fluorescencia seria positiva.

En la inmunofluorescencia indirecta tiene dos utilidades que son: la deteccion de Ac en los sueros de pacientes o la deteccion de Ag virales en las clulas.
En esta se utiliza un paso adicional al mencionado en la IFD y es la introduccin de un suero especifico o anticuerpo monoclonal para que se pegue a los Ag virales que pueda haber en la muestra del paciente o las clulas de los cultivos.

Una vez ocurre la reaccion Ag-Ac se hace un lavado y luego se detecta la presencia de stos mediante un anti-anticuerpo marcado con FITC.

La diferencia entre la IFI y la IFD, radica en que al Ac especifico usado en la IFI amplifica la reaccin y permite aumentar la sensibilidad de la prueba aunque se disminuye la especificidad.
La otra ventaja de la IFI es que el Ac marcado con FITC es un reactivo comun, independiente del antigeno viral que se est buscando, y esto es importante desde el punto de vista de costos.

Se puede hacer la deteccin de Ac (IgM o IgG)o de Ag virales.


Para la deteccion de IgM es necesario hacer tratamientos especiales antes de hacer la prueba.

Si lo que se va a detectar son Ac: Se tiene un soporte solido, cubierto con un Ag que puede ser el virus completo o una fraccion del mismo. Se agrega suero del paciente (que supuestamente contiene los Ac) a los pozos del microplato que contienen el Ag o virus adherido y se hace una incubacion. Luego se agrega un anti-Ac el cual esta marcado con una enzima y se incuba.

Luego

se agrega el sustrato especifico de la enima para que ocurra la reaccion y se proce a hacer la lectura visual o mediante un espectofotometro.

Para la deteccion de Ag se hace a la inversa: El soporte tiene adheridos Ac especificos contra el virus que se esta buscando. Luego de agregar la muestra e incubar, se aade otro Ac marcado con la enzima y se sigue el proceso igual que para la deteccin de Ac.

Los Ac que esta prueba detecta en los sueros de los pacientes se denominan Ac neutralizantes, pues tienen la capacidad de neutralizar la infectividad del virus. Esta neutralizacin es especifica de cada cepa viral, permitiendo diferenciar a cuales es suceptible o resistente el paciente.

Idealmente se utilizan sueros pareados de un paciente (fase aguda y fase convaleciente). Se adiciona el virus y se incuba durante un tiempo para que ocurra la reaccion Ag-Ac y finalmente se agregan los globulos rojos, nuevamente se incuba para que ocurra una nueva reaccin entre los virus que quedaron libres (que no fueron neutralizados por los Ac) y los GR que tienen el receptor especifico para ese virus.

En esta prueba, la muestra de suero del paciente reacciona con antgeno del laboratorio y complemento adicional. Los complejos antgeno-anticuerpo se unen, activan y fijan (consumen) al complemento. A continuacin, se analiza el complemento residual por medio de la lisis de hemates recubiertos de anticuerpos.

Se pueden detectar Ag o Ac.


Para detectar Ag se mezcla la muestra problema con una cantidad conocida de Ag marcado (cromio es el mas utilizado) y luego se agrega una cantidad conocida de Ac para poner a competir el Ag. Luego se separan los complejos inmunes y se detecta en el sobrenadante con un contador de centelleo la presencia de Ag radioactivo libre.

El RIA se basa en la competencia existente entre el antgeno no marcado y una cantidad conocida del antgeno marcado para formar los complejos AgAc o Ag*Ac. Con estos tres componentes (Ag, Ag* y Ac) puede realizarse el ensayo en el que manteniendo constante la cantidad de Ag* y Ac se observar que a mayor cantidad de Ag menos Ag* queda unido a la cantidad fija de Ac (y por tanto menos radiactividad), lo que permitir relacionar la radiactividad con la concentracin de Ag.

Las esferas de latex son esferas de poliestireno que se unen fcilmente al fragmento Fc de las inmunoglobulinas G y M. Los Fab quedan expuestos y son capaces de unirse al antgenos que se encuentra en la muestra. Cuando los anticuerpos acoplados a las partculas de ltex se unen al antgeno se produce una reaccin de aglutinacin visible.