Diagnstico de Laboratorio en Virologa

2007

Mtodos de diagnstico en Virologa

1. Examen directo.
2. Examen indirecto (Aislamiento del virus) 3. Serologa

Exmen directo
1. Deteccin de antigeno 2. Microscopa electrnica 3.Microscopia de luz Inmunofluorescencia, ELISA etc. Morfologa de partculas virales histologia cuerpos de inclusin

4. Deteccin del genoma viral Hibridizacin con acidos nucleicos especificos Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)

Pruebas indirectas
1. Cultivo celular Efecto citoptico (ECP)
hemadsorcin Inmunofluorescencia 2. Huevos 3. Animales Hemaglutinacin Inclusin de cuerpos Enfermedad o muerte

Serologa
Deteccin del incremento de anticuerpos entre la fase aguda y convaleciente de la infeccin o la deteccin de anticuerpos IgM en la infeccin primaria.
Tcnicas clsicas 1. 2. 3. 4. 5. Fijacin de complemento(CFT) Inhibicin de la hemaglutinacin IH Inmunofluorescencia (IF) Neutralizacin Inmunoelectroforesis Newer Techniques 1. 2. 3. 4. 5. Radioinmunoensayo (RIA) Enzyme linked immunosorbent assay (EIA) Aglutinacin Western Blot (WB) RIBA, Inmunoensayo en linea

Aislamiento viral
Los cultivos celulares son los mas ampliamente usados para aislamiento viral, existe tres tiposde cultivo celular.
1. Clulas primarias - Rin de Mono 2. Clulas semi-continuas - Rin de embrin humano. 3. Clulas continuas - HeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCK Los cultivos primarios son ampliamente conocidos debido a que soportan un rango amplio de virus. Sin embargo presentan la dificultad de su mantenimiento. Las Clulas continuas son las mas fciles de manejar pero el rango que soporta es limitado.

Cultivo celular
La multiplicacin viral produce:

Efecto citoptico(ECP) - aglomeracin de las celulas o formacin de sincitios, puede ser especifico o no especifico. Unidades formadoras de placas (UFP)

2. Hemadsorcin - Las clulas tienes la habilidad de unirse a los globulos rojos de mamferos.

Confirmacin de la identidad de los virus puede ser utilizandoante neutralization, haemadsorcin o inmunofluorescencia.

Efecto citoptico(1)

ECP de Enterovirus 71 en cultivo celular , note el agrupamiento de las clulas. (Virology

Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of Cape Town)

Cytopathic Effect (2)

Formacin de sincitios en cultivo celular causado por RSV (arriba), y virus del sarampin(abajo).
(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)

Hemadsorcin

Formacin de sincitios causados por mumps virus y hemadsorcin de eritrocitos en una superficie de clulas.
(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)

Inconvenientes del Cultivo Celular

Se requiere de un periodo largo(4 semanas aprox.) hasta dar el resultado final. Baja sensibilidad, la sensibilidad depende de las condiciones de manejo de la muestra. Susceptible a contaminacin bacteriana. Susceptible a sustancias txicas presentes en la muestra. Muchos virus no crecen el cultivo celulares: Hepatitis B, parvovirus, papillomavirus.

Tcnicas de Cultivo rpido

Las tecnicas de cultivo rpido estan disponibles uqe permiten detectar antigeno viral dentro de 2 4 dias despues de la inoculacin. Prueba rapida para CMV es el mejor ejemplo,

Las clulas crecen en laminas individuales en una botella de plstico. Despues de la inoculacin, se deja una hora de adsorcin de el virus y se incuba por 2 4 dias La lmina es examinada para detectar la presencia de antigenos tempranos CMV por inmunofluorescencia.

Cultivo celular rpido para CMV

(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

Virus aislados mediante cultivo celular

Faxilmente aislados en cultivo celular Herpes Simplex Cytomegalovirus Adenoviruses Polioviruses Coxsackie B viruses Echoviruses Influenza Parainfluenza Mumps Respiratory Syncytial Virus Menos frecuentes de ser aislados Varicella-Zoster Measles Rubella Rhinoviruses Coxsackie A viruses

Microscopa electrnica
106 particulas virales por mL son requeridos para la visualizacin Los virus pueden ser visualizados en los siguientes especmenes:

Heces

Rotavirus, Adenovirus Norwalk like virus Astrovirus, Calicivirus VZV papilomavirus,

Fluido vesical Raspado de piel

Electromicrografas

Adenovirus

Rotavirus

(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)

Inmuno-Microscopa electrnica
La sensibilidad y especificidad de la ME es incrementada mediante la IME.Las variantes que existe son :

Inmuno-Microscopia electrnica(IME) las muestras son tratadas con anticuerpos especificos contra el virus. Las particulas virales presentes aglutinan debido a la presencia del anticuerpo. Immuno- Microscopia electrnica en fase solida(SPIEM) Se usa de un soporte donde esta fijado el anticuerpo, al cual se unir la particula viral.

Inconvenientes de la Microscopa Electrnica

Equipo de alto costo Mantenimiento de alto costo Experiencia del observador Sensibiidad muy baja

Serologa
Criterios para el diagnostico de una infeccion primaria

Incremento de 4 o mas veces del titulo de anticuerpos IgG o totales entre la fase aguda y convaleciente. Presencia de IgM Seroconversion Un titulo alto de IgG que no presente reaccin cruzada.

Criterios para el diagnostico de una reinfeccin

Incremento de 4 o mas veces del titulo de anticuerpos IgG o totales entre la fase aguda y convaleciente. Ausencia o leve incremento de IgM.

Curva serolgica tpica despues de una infeccin aguda

Durante la reinfeccin las IgM pueden estar ausentes o presentar un nivel bajo.

Respuesta Inmune a Infecciones Diferentes

CONVALESCIENTE IgG
INFECCION CON UN TIPO VIRAL INFECCION CON UN VIRUS DIFERENTE

IgM

AGUDO

MESES

Fijacin de Complemento

Fijacin de Complemento en placa de Microtitulacin. Las filas 1 y 2 exhiben la fijacin de complemento en muestra aguda y convalesciente respectivamente. Observe el incremento del titulo de anticuerpos que indica infeccin reciente.

CRITERIOS PARA EL MANEJO DEL DIAGNOSTICO LABORATORIAL

UNA BUENA EVALUACION DEL PACIENTE
UNA MUESTRA APROPIADA TRANSPORTE ADECUADO DE LA MUESTRA

ELECCION CORRECTA DE LA PRUEBA

MANEJO CORRECTO DE LA PRUEBA ELEGIDA LECTURA E INTERPRETACION CORRECTA DE LOS RESULTADOS REPORTE OPORTUNO DE LOS RESULTADOS

PRUEBA DE HEMAGLUTINACION ( Titulacin de Ag )

+
VIRUS ( ARBOVIRUS) G. R. GANSO COMPLEJO VIRUS - G. R. A DETERMINADO pH REACCION U OBSERVACION POSITIVA

1: 10 1: 20

1: 40

1: 80

1: 160 1: 320 1: 640

C C.

REACCION U OBSERVACION NEGATIVA

32 UH 16 UH 8 UH

4 UH. 2 UH. 1 UH.

MCZ/2000

PRUEBA DE INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION

VIRUS

SUERO

Reaccin Ag - Ac

+
GLOBULOS ROJOS POSITIVO

NEGATIVO

INTERPRETACION DE RESULTADOS

PRUEBA DE INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION

MONOSUEROS : (fase aguda) 1 : 1280 1: 2560 RESPUESTA PRIMARIA RESPUESTA SECUNDARIA

SUEROS PAREADOS :

AUMENTO EN 4 DILUCIONES RESPUESTA PRIMARIA

1:10 a 1:160

1:1280 a 1:10240 RESPUESTA SECUNDARIA

PRUEBA DE ELISA INDIRECTA PARA DETECTAR Ac

+
POCILLO CON Ag

Y
HRP
SUERO (Ac) CONJUGADO SUSTRATO

PRUEBA DE ELISA DE CAPTURA PARA DETECTAR Ac

+
SUERO (Ac) POCILLO CON Anti IgM

HRP
CONJUGADO (Ag ~Anti Ag) SUSTRATO

INTERPRETACION DE RESULTADOS
PRUEBA ELISA DE CAPTURA
MONOSUEROS: RATIO IgM / IgG

D.O > 1.4

RESPUESTA PRIMARIA

D.O < 1.4

RESPUESTA SECUNDARIA

ELISA para HIV

Microplaca ELISA para HIV : El color indica reactividad.

ARBOVIRUS IgM Antibody ELISA

ELISA DE CAPTURA IgM

SUBSTRATO
ANTICUERPO MONOCLONAL

MARCADO CON PEROXIDASA

ANTGENO MUESTRA SRICA DEL PACIENTE IgM ANTI-HUMANO

ARBOVIRUS IgG Antibody ELISA

ENZYME SUBSTRATE ENZYME LABELED ANTI-HUMAN ANTIBODY SERUM SAMPLE VIRAL LYSATE ANTIGEN

PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

+
SUERO (Ac)

FITC
CONJUGADO (Anti Ag~FITC)

POCILLO CON Antgeno

MONTAR CON GLICEROL

Western Blot
HIV-1 Western Blot

1: Control Positivo 2: Control Positivo Muestra A: Negativo Muestra B:Indeterminado Muestra C: Positivo

Utilidad de los resultados serolgicos

La utilidad de cada resultado serologico depende del tipo de virus. Por ejemplo, virus como rubola y hepatitis A, el inico de sintomas coinciden con el desarrollo de anticuerpos.La deteccin de IgM o incremento de IgG en suero indica enfermedad.

Sin embargo, muchas virus producen la enfermedad antes de la aparicin de anticuerpos: Virus respiratorios En este caso, no es util en el mismo momento de la enfermedad.
Existe virus que producen enfermedades por meses o aos despues de la seroconversin: HIV y rabia . En este caso la presencia de anticuerpos es suficiente para hacer un diagnostico definitivo.

Desventajas de la Serologa

Largos periodos de tiempo son requeridos para obtener la muestra de sueroaguda y convaleciente.
Infecciones no produce una respuesta humoral . Reacciones cruzadas ente virus relacionados. Encefalitis japonesa y Dengue F.A. positivos. Puede producir falsos

Pacientes inmunosuprimidos presentan una reduccin o ausencia de respuesta humoral. Pacientes receptores de productos sanguineos pueden dar falsos positivos.

Diagnostico rpido basado en la deteccin de Antigeno viral

Aspirado nasofaringeo Influenza A y B Parainfluenza Adenovirus Rotavirus Adenovirus Picornavirus HSV VZV CMV

Heces

Piel Sangre

Immunofluorescencia

Inmunofluorescencia para detectar el virus rbico. (Source: CDC)

(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

CMV Prueba pp65 antigenemia

(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)

Ventajas y Desventajas
Ventajas

Es rpido de realizar, en horas. La sensibilidad es reducida comparada con del cultivo celular, puede ser menos del 20% la especificidad es reducida. Requiere muestras en buenas condicones.

Problemas

Diagnstico Molecular

Mtodos moleculares

La deteccin del genoma viral es conocido como Mtodos moleculares. Actualmente tiene mucha interes la plicacin de este mtodo.

Mientras su uso se incrementa, el rol que juega actualmente en el diagnostico de laboratorio de los virus es pequeo comparado con los mtodos convencionales.
Es cierto que este mtodo incrementara su aplicacin en el diagnostico en un futuro cercano.

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

PCR

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

FUNDIR PARA SEPARAR LAS HEBRAS

PCR

DENATURACION

UNION DE LOS PRIMERS

ANILLAMIENTO

EXTENSION DE LOS PRIMERS CON LA POLIMERASA

EXTENSION

PRIMERS EXTENDIDOS

PROD. AMPLIFICADO

VIRUS DENGUE 2
TRINIDAD53 TRINIDAD-53 INDIA57 INDIA-57 AMAZONAS96 PERU-96 (Amazonas) TONGA74 TONGA-74 PUERTORI69 PUERTO RICO-69

SRILANK90b SRI LANKA-90b SRILANKA89 SRI LANKA-89 SRILANK90a SRI LANKA-90a SRILANK85a SRI LANKA-85a SRILANK85b SRI LANKA-85b SRILANKA82 SRI LANKA-82 SEYCHEL77b SEYCHELLES-77b SEYCHEL77a SEYCHELLES-77a INDONESI76 INDONESIA-76 SOMALIA84 SOMALIA-84 BURKFAS83 BURKINA FASO-83 TAILAND80c TAILANDIA-80c MALASIAM3 MALASIA-M3 TAILAND80a TAILANDIA-80a BRASIL90 BRASIL-90 JAMAICA83 JAMAICA-83 TAILAND64 TAILANDIA-64 MALASIAM2 MALASIA-M2 MALASIAM1 MALASIA-M1 TAILAND80d TAILANDIA-80d TAILAND80b TAILANDIA-80b TAIWAN87 TAIWAN-87 FILIPINA83 FILIPINAS-83 SRILANKA69 SRI LANKA-69 SRILANKA68 SRI LANKA-68 NUEGUINC44 NUEVA GUINEA C-44