Reunio de Avaliao de Projetos RCT-PETROBRAS

Rio de Janeiro 13 de dezembro de 2011

Projeto
Modificao Gentica de Fungos Filamentosos para Incremento da Expresso de Enzimas Celulolticas
Coordenador: Prof. Fernando Araripe Torres Perodo: 12/2005 a 03/2007

Equipe Executora UnB UFRJ - UFAM

Prof. Fernando Araripe Torres Profa Ldia Maria Pepe de Moraes Janice Lisboa De Marco Bruno Benoliel Camila Marinho Silva Saulo Siqueira

Equipe UnB

Equipe UFRJ - UFAM

Prof. Nei Pereira (UFRJ) Prof. Spartaco Astolfi Filho (UFAM)

Introduo

Resduos Lignocelulsicos

386 x 106 t bagao de cana/ano 38% do contedo energtico no aproveitado Poderia dobrar a produo de etanol no Brasil

Rota Petrobras
Resduos Lignocelulsicos
CELULOSE Hidrlise qumica CELULOSE SOLVEL Hidrlise enzimtica HEMICELULOSE LIGNINA

GLICOSE
Fermentao

XILOSE

ETANOL

RESDUO SLIDO

Enzimas: sinergismo

Justificativas

Preo das enzimas um gargalo Produo nacional Fungos filamentosos: timos produtores Biodiversidade brasileira Melhoramento gentico necessrio Faltam ferramentas moleculares

Objetivo geral
Desenvolvimento de linhagens de fungos filamentosos hiperprodutoras de enzimas celulolticas

Objetivos especficos

Screening de fungos produtores de celulases Construo de vetor de expresso para fungos filamentosos Clonagem no vetor construdo dos genes de Humicola grisea para as enzimas endoglucanase (egl2), celobiohidrolase 1.2 (cbh1.2) e glicosidase (bgl4) Transformao de uma linhagem selecionada de fungo filamentoso com os vetores de expresso Anlise dos transformantes quanto produo de celulases

Metodologia

Screening de fungos celulolticos (UFRJ/UFAM) Caracterizao enizmtica (UFRJ/UFAM) Seleo de um isolado (UFRJ/UFAM/UnB) Desenvolvimento de vetores de transformao (UnB) Transformao gentica (UnB) Anlise dos transformantes (UnB)

Resultados

Fungos Celulolticos (UFRJ)

Trichoderma reesei RUT C30 Humicola grisea var.thermoidea Aspergillus niger ATCC 16404 Penicillium funiculosum ATCC 11797 Trichoderma harzianum IOC-3844 Trichoderma harzianum IOC-4038

Atividades Enzimticas
Linhagem
Papel de filtro T. reesei RUT C30 H. grisea var thermoidea A. niger ATCC 16404 P. funiculosum ATCC 11797 T. harzianum IOC-3844 T. harzianum IOC-4038 17,8 6,1 45,7 0,9 36,2 4,6 353,8 29,4

Atividade (UI/L)
CMC (EG) 103,0 9,3 317,0 1,0 386,2 16,9 Celobiose (BG) 84,2 4,4 73,9 1,5 1627,3 10,8 Avicel (CHB) 35,6 1,4 153,3 9,7 88,4 3,0 727,0 28,0

2263,3 104,8 1835,5 110,7

494,3 22,0 6358,1 219,8 100,0 4,1 558,5 31,8

752,3 36,0 744,7 18,0

512,0 28,5 134,7 8,4

Atividades em papel de filtro, CMC e celobiose: melhores valores obtidos durante os experimentos; Atividades em avicel: Valores obtidos nos extratos finais. Experimentos em frascos de 1L contendo celulignina semi-deslignificada em meio Mandels. Fermentao aps etapa de pr-inculo.

Seleo
Linhagem Atividade especfica (UI/mg protena) FPases
T. reesei H. grisea A. niger ATCC 16404 T. harzianum IOC-4038 T. harzianum IOC-3844 P. funiculosum 0,28 1,33 0,58 1,01 14,00 7,98

EG
1,64 14,91 5,70 6,42 67,14 43,14

BG
1,34 3,60 52,91 7,46 5,30 19,06

Fungos Celulolticos (UFAM)

Microrganismo Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Aspergillus flavus Aspergillus sp Aspergillus ustus Penicillium funiculosum Penicillium versicolor Penicillium furcatum Penicillium stecki Origem Fermentado de cana-de-acar da Usina Jayoro S/A Vinhoto de cana-de-acar da Usina Jayoro S/A CEFET Fermentado de cana-de-acar da Usina Jayoro S/A Bagao de cana-de-acar da Usina Jayoro S/A UFRJ Vinhoto de cana-de-acar da Usina Jayoro S/A Fermentado de cana-de-acar da Usina Jayoro S/A Vinhoto de cana-de-acar da Usina Jayoro S/A

Atividades Enzimticas
Microrganismo Atividade CMCase (U/mL) Atividade -glucosidase (U/mL) Atividade FPase (U/mL)

A. niger A. ochraceus A. flavus Aspergillus sp A. ustus A. funiculosum P. versicolor P. furcatum P. stecki

0,124 0,0035 0,1491 0,0127 0,1160 0,0009 0,0889 0,0049 0,1799 0,0060 0,1559 0,0091 0,1316 0,0157 0,1149 0,091 Nd

0,8216 0,0111 0,1112 0,0086 1,2406 0,0184 0,3206 0,012 1,309 0,030 0,937 0,0102 0,3683 0,0036 0,1636 0,0 Nd

0,0595 0,0266 0,0718 0,0017 0,0626 0,0004 0,0248 0,0021 0,0733 0,0097 0,0922 0,0025 0,1380 0,0089 0,07184 0,0017 Nd

Construo de vetor de expresso para fungos filamentosos

Construo dos Vetores de Expresso para Fungos Filamentosos

Objetivo: construo de vetores de expresso para fungos filamentosos que possam ser utilizados para a expresso heterloga de genes de celulases

Elementos principais

Sequncias para seleo e replicao em bactria (Ori e marca de seleo) Marca de seleo para fungos filamentosos Regio promotora de fungos filamentosos Stio para clonagem dos genes Regio terminadora da transcrio (TT)

Vetor desejado

Clonagem de Elementos Regulatrios

Promotores gpdA (Aspergillus nidulans) cbh1.1 (Humicola grisea) cbh1.2 (Humicola grisea) Regio Terminadora da Transcrio (TT) TT do gene trpC (Aspergillus nidulans)

1) Adio do Polilinker e Regio Terminadora da Transcrio (TT)

FF1-UP 5-AATTCTGCAGGATCCGATATCGC FF1-DOWN 5-GGCCGCGATATCGGATCCTGCAG

EcoRIPstIBamHIEcoRVNotI 5-AATTCTGCAGGATCCGATATCGC GACGTCCTAGGCTATAGCGCCGG-5

voltar

1) Marcador 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 2) pPE1/BamHI; 3) pPE1/SmaI; 4) pPE1/XbaI; 5) pPE1 intacto

Regio Terminadora da Transcrio (TT)

Ter-1 5-TCCGCGGACTTAACGTTACTGAAATCATCAAAC (SacII) Ter-2 5-AGAGCTCAGAAAGAAGGATTACCTCTAAAC (SacI)

Polilinker

pPE2 foi digerido com SacII e SacI para confirmar a presena da regio TT

Anlise de restrio do vetor pPE2. 1) Marcador 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 2) pPE2 digerido com SacII e SacI; 3) pPE2 intacto.

2) Clonagem do promotor gpdA

- gpdA de A. nidulans, promotor forte e constitutivo - usar vetor pAN7-1 como template

Gpd-1 5-CAAGCTTTGTACAGTGACCGGTGACTC (HindIII) Gpd-4 5-CGAATTCGGTGATGTCTGCTCAAGCG (EcoRI)

Anlise de restrio do vetor pPE3. 1) pPE3 intacto; 2) pPE3/EcoRI + HindIII; 3) Marcador 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

3) Clonagem do cassete hph

Polilinker

Anlise de restrio do pPE5

4) Clonagem dos promotores cbh1.1 e cbh1.2

promotor do gene cbh 1.1 CBH1.1-F (24 mer) 5-CAAGCTTCGTTACACTCGGCGGAC (HindIII) CBH1.1-R (29 mer) 5-GGAATTCTTTGAAGGAGGGTGACTGATGT (EcoRI) promotor do gene cbh 1.2 CBH1.2-F (26 mer) 5-CAAGCTTCCGGTAAGCGCATACGGGA (HindIII) CBH1.2-R (28 mer) 5-GGAATTCTTGAAAGACTGCTGCTGAGAT (EcoRI)

1) EcoRI/HindIII 2) Promotor chh1.1 3) Promotor cbh1.2

5) Clonagem dos genes de celulases nos vetores de expresso

Objetivo: Clonar os genes egl2, bgl4, cbh1.2 no vetor pPE5

Genes a serem clonados

-glicosidase (bgl4) endoglicanase 2 (egl2) celobiohidrolase 1.2 (cbh1.2) celobiohidrolase 1.1 (cbh1.1)

Todos os genes so de Humicola grisea e foram amplificados por PCR a partir dos cDNA j clonados

EGL2 EGL-F 5-GGAATTCACCATGAAGCACAGTGTCCTTGC (EcoRI) EGL-R 5-GGCGGCCGCCTATGGCACGTATTTCTTGAGAAGGGA (NotI) BGL4 Bgl4-F 5-GGAATTCATCATGTCTCTTCCTCCGGA (EcoRI) Bgl4-R 5-GGATCCTTACTCCTTGCGAATCAAGCTATC (BamHI) CBH1.2 1.2cdF2 5-GGAATTCAAGATGCAGATCCAAGAGC (EcoRI) 1.2cdR2 5-GGCGGCCGCTTAGACGTTGACGGTCCC (NotI)

Clonagem do gene da celobiohidrolase 1.2 Humicola grisea

1.2cdF2 5-GGAATTCAAGATGCAGATCCAAGAGC (EcoRI) 1.2cdR2 5-GGCGGCCGCTTAGACGTTGACGGTCCC (NotI) Amplificado: cDNA; Vent polimerase (alta fidelidade) 1 2

1,4 kb

Amplificao do gene cbh1.2. 1) Marcador BstEII 2) PCR com os primers 1.2cdF2/1.2cdR2.

Clonagem dos genes egl2 e bgl4 de Humicola grisea

Sequncia dos oligonucleotdeos iniciadores utilizados nas reaes de PCR

PRIMER
EGL-F EGL-R Bgl4-F1 Bgl4-R1 Bgl4-F 3glu

SEQNCIA 5 - ggaattcaccatgaagcacagtgtccttgc 5 - ggcggccgcctatggcacgtatttcttgagaaggga 5 - ggaattcgggccgtccatctgggaca 5 - agcggccgcttactccttgcgaatcaagctatc 5 - ggaattcatcatgtctcttcctccgga 5 - ggatccttactccttgcgaatcaagctatc

Tm 50C 50C 62C 66C 58C 68C

STIO EcoRI NotI EcoRI NotI EcoRI BamHI

cbh1.2
1 A 2 B 1

egl2
2 C
1,5 kb

bgl4
1 2

1,9 kb 1,3 kb

1,0 kb

1,5 kb 1,0 kb

pP5CBH1.2 pPECBH1.2

Transformao de Fungos Filamentosos

Objetivo: Desenvolver protocolo de transformao de uma linhagem hospedeira de fungo filamentoso para a expresso heterloga de genes de celulases.

Fungos selecionados

Aspergillus awamori Aspergillus niger Penicillium funiculosum Trichoderma harzianum 3844 e 4038

Primeira Etapa
Teste resistncia ao antibitico higromicina B

A. awamori
a b
1

6 5

a) A. awamori, 10 dias de crescimento b,c) Teste de resistncia a higromicina 1- 0 g/mL 2- 10 g/mL 3- 50 g/mL 4- 100 g/mL 5- 200g/mL 6- 300 g/mL

Aspergillus niger
a
a) A. niger, 7 dias de crescimento b)Teste de resistncia a higromicina 10 g/mL 2- 10 g/mL 3- 50 g/mL 4- 100 g/mL 5- 200 g/mL 6- 300 g/mL

b
1 5 4

Penicillium funiculosum
a b
2 1

c
5

4 6

d
8

7 9

a) Penicillium funiculosum, 10 dias de crescimento b,c,d) Teste de resistncia a higromicina 1) 0 g/mL, 4) 100 g/mL 7) 500 g/mL 2) 10 g/mL, 5) 200 g/mL 8) 700 g/mL 3) 50 g/mL, 6) 300 g/mL 9) 1000 g/mL

Trichoderma harzianum 4038

a
1

a) 1- Trichoderma harzianum 4038, 10 dias de crescimento;

2 3

a e b) Teste de resistncia a higromicina: 1- 0 g/mL 2- 10 g/mL 3- 50 g/mL 4- 100 g/mL 5- 200 g/mL 6- 300 g/mL

Trichoderma harzianum 3844

a
2 1 A) 1- Trichoderma harzianum 3844, 10 dias de crescimento A e B) Teste de resistncia a higromicina 1- 0 g/mL 2- 10 g/mL 3- 50 g/mL 4- 100 g/mL 5- 200 g/mL 6- 300 g/mL 6 5

b
4

Segunda Etapa
Teste de transformao por biolstica

Biolstica

Equipamento BIOMICS Particle Acceleration System

Esporos de T. harzianum 3844: 3 dias de crescimento

0g/mL de higromicina

50g/mL de higromicina

100g/mL de higromicina

200g/mL de higromicina

Transformao

Cotransformao com genes egl2 e cbh1.2 Obteno de 6 transformantes: THBR-01 a -06 Anlise em meio contendo CMC e Celuflok

THBR-01

THBR-02

THBR-03

THBR-04

THBR-05

THBR-06

Discusso e Concluses

T. harzianum pode ser usado como plataforma para produo de celulases

3 vetores de expresso foram construdos: pPE5, pPE6 e pPE7 Dados preliminares sugerem que houve incremento de produo de celulases no fungo transformado

Desdobramentos

Clonagem de genes de amilases e lipases no vetor pPE5

Melhoramento gentico de Penicillum funiculosum

Patente
VETOR MODULAR PARA EXPRESSO DE ENZIMAS EM FUNGOS FILAMENTOSOS, FUNGO FILAMENTOSO TRANSFORMADO COM DITO VETOR MODULAR E MTODO PARA PRODUZIR UMA PROTENA DE INTERESSE NO INTEROIR DO DITO FUNGO FILAMENTOSO

Depsito em 28/07/2008 PI 0803782-5