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BASE RAZIONALE
ATTENUAZIONE DI MICRORGANISMI
PATOGENI
WRIGHT
c) PATOGENI UCCISI
V. ANTITIFICO
V. CONTRO Rickettsia prowazekii (TIFO
PETECCHIALE)
VACCINI BATTERICI
b) VARIANTI APATOGEN VIVENTI
SVANTAGGI
PURIFICAZIONE COSTOSA
ALTERAZIONE DELLA CONFORMAZIONE NATIVA
>ALTERAZIONE DELL’ANTIGENICITA’
New Methods
• Recombinant DNA
•Single gene (subunit)
S-antigen mRNA
Hepatitis B
vaccine
cDNA
raised in yeast
Express plasmid
S-antigen mRNA
protein
PRODUZIONE DI VACCINO CONTRO EPATITE B IN LIEVITO
(Difficile da purificare)
(Cellula ospite)
(Solubile)
CLONAZIONE DEL GENE gD MODIFICATO
IN UN VETTOTE DI ESPRESSIONE EUCARIOTICO
FORMA MODIFICATA DI gD
CONTESTAZIONI
CAUSA DI MALATTIE IN PZ IMMUNODEPRESSI
(AIDS…)
IMPOSSIBILITA’ DI DISTINGUERE GLI INDIVIDUI
1 SUBUNITA’ A
PEPTIDE A2
5 SUBUNITA’ B IDENTICHE
SELEZIONE TETRACICLINA!!
• 90% PROTEZIONE MA
EFFETTI COLLATERALI
LE SPECIE DI Salmonella
CEPPI DI Salmonella: FEBBRI INTESTINALI, MORTE INFANTILI,
FEBBRE TIFOIDE, INTOSSICAZIONE ALIMENTARE
DOPPIA DELEZIONE
COMPOSTI AROMATICI
CEPPI ATTENUATI DI Salmonella: INFEZIONI
DI BASSO LIVELLO. VIRULENZA DI 106
VOLTE O PIU’.
VIRUS VACCINO
POXVIRUS, VAIOLO, DNA DOPPIO FILAMENTO,
REPLICAZIONE CITOPLASMATICA
(INDIPENDENTE DALLA CELLULA OSPITE).
INFETTA UOMO E MOLTI ALTRI VERTEBRATI E
INVERTEBRATI.
BEN CARATTERIZZATO A LIVELLO
MOLECOLARE
STABILE, SOLITAMENTE BENIGNO
VETTORI VACCINICI
VIRUS VACCINO
MA….
GENOMA MOLTO GRANDE, PRIVO DI SITI DI RESTRIZIONE
UNICI
IMPOSSIBILE INSERIRE DIRETTAMENTE NEL GENOMA
VIRALE ALTRO DNA
TRASFEZIONE DI
FIBROBLASTI
DI EMBRIONI DI POLLO
(TK NEGATIVE)
PRECEDENTEMENTE
INFETTATE CON
IL VIRUS VACCINO WT
(TK POSITIVO)
2. INTEGRAZIONE DEL GENE DELL’ANTIGENE NEL
DNA DEL VIRUS VACCINO
TK TK
DOPPIO
TK CROSSING-OVER
HBcAg
Cellule ospiti: TK-
Virus ricombinato: TK-
ESEMPIO:
ESPRESSIONE SUI FLAGELLI DI UN
ORGANISMO NON PATOGENO DI UNO
SPECIFICO EPITOPO DERIVANTE DA UN
BATTERIO PATOGENO PER REALIZZARE UNA
IMMUNOGENICITA’ PROTETTIVA.
COSTRUZIONE DI UN
VACCINO ANTI-COLERA
INSERIMENTO DI UN
OLIGONUCLEOTIDE SINTETICO
(EPITOPO DEALLA SUBUNITA’ B DELLA
TOSSINA COLERICA) IN UNA PORZIONE
DEL GENE DELLA FLAGELLINA DI
Salmonella.
IMMUNIZZAZIONE GENETICA
TRASFERIMENTO DI UN GENE CODIFICANTE
UN ANTIGENE ALL’INTERNO DI UN
ORGANISMO OSPITE CHE NON ESPRIME TALE
ANTIGENE IN CIRCOSTANZE NORMALI.
ANTIGENE: DNA O RNA
VACCINI AD RNA: POCHI ESEMPI (BREVE
ESPRESSIONE)
VACCINI A DNA: SEMPRE PIU’ NUMEROSI
VACCINI A DNA
COSTITUITI GENERALMENTE DA VETTORI PLASMIDICI
(DERIVATI DA BATTERI) CHE CONTENGONO GENI
ETEROLOGHI (TRANSGENI) INSERITI SOTTO IL
CONTROLLO DI UN PROMOTORE EUCARIOTICO,
DETERMINANDO ESPRESSIONE PROTEICA IN CELLULE DI
MAMMIFERO
UMORALE
CELLULARE
IMMUNITA’ UMORALE:
PRODUZIONE DI ANTICORPI ANTIGENO-SPECIFICI DA
PARTE DI CELLULE B ATTIVATE
NEUTRALIZZAZIONE DELL’AGENTE PATOGENO
(Sufficiente da sola per la profilassi di alcune
malattie, Es. EPATITE B)
resistance
gene
ori
bacterial resistance
E. coli origin of replication gene:
- ColE1 - kanamycin
- no mammalian origin - none
DNA
Vaccines
Inoculation technology
needle inoculation
i.m.
i.d.
gene gun
air
food uptake
Types of Injection for DNA
Vaccines
Gene Gun (bombardment)~ Propels DNA-coated gold
particles directly into the cytoplasm of cells in target tissue
by means of electrical discharge or helium pulse
b
materiale
patogeno plasmide
genetico
modificato
c
La preparazione di un Vaccino a DNA muscolo
solitamente si attua isolando uno o più geni
dell’agente patogeno e integrandoli in
plasmidi (a), piccoli anelli circolari di DNA.
I plasmidi vengono rilasciati in piccoli
gruppi di cellule, spesso per iniezione nelle
pelle
cellule muscolari (b) o per trasferimento
attraverso la pelle utilizzando una pistola
genica (gene gun) (c).
I geni codificano per gli Ag del patogeno.
Gli Ag prodotti sono in grado di stimolare
Mechanism of immunisation
T-cell selection
plasmid and stimulation cytotoxic
T-cell response
CD8+ T CELL
cross priming
MHC I
transfection Th I
myocyte
APC
MHC II
Th II CD4+ T Cell
secretion
antibody-dependent
B-cell stimulation immune responses
and selection • neutralisation
• ADCC • C-lysis
Features of DNA vaccination
Antigenicity of expressed viral antigens similar to that
observed during natural infection
tumor induction
due to chromosomal integration
tolerance
due to long-term presentation of antigen
genes
auto-immune reactions
correlated with the induction of anti-DNA antibodies
type of sequences
homology to chromosomal DNA sequences
route of administration
i.m., i.d., s.c., etc.
type of tissue
rate of proliferation?
supercoiledness?
Chromosomal integration:
Where should we look?
in every tissue
extensive biodistribution of naked DNA observed in mice
in gonads
major concern of germ line gene transfer
PCR
most sensitive
sensitivity is limited
due to rapid biodistribution of DNA
at which time point after inoculation
5 days or 15 days
integration assay, if DNA is detected in a given tissue by PCR
Chromosomal integration:
Should we look for it in all cases?
yes
because consequences could be detrimental
preventive vaccines will be used in healthy adults or children