Bruna Oliveira Gabriela Moreira Liliana Almeida Marlene Ferreira

Laboratrio de Bioqumica-Fisiologia 2011/2012

 Demonstrar algumas propriedades fisiolgicas dos elementos figurados do sangue caracterizao elementar das clulas sanguneas e da sua citognese referncia das funes fisiolgicas dos diferentes tipos de clulas

Avaliar tcnicas de estudo dos elementos figurados do sangue bem como potenciais aplicaes

Sangue
Tecido conjuntivo lquido que circula pelo sistema vascular sanguneo dos animais vertebrados Desempenha um papel de intermedirio e de transporte As clulas sanguneas so : produzidas na medula ssea vermelha ; renovadas constantemente; origem exgena;

Fig.1-Esquema que demonstra a provenincia dos elementos figurados do sangue.

Composio do sangue Sangue

Elementos figurados Plasma

Hemcias

Leuccitos

Plaquetas

Granulcitos Neutrfilos Eosinfilos Basfilos

Agranulcitos

Moncitos
Linfcitos

Um adulto pode ter 4 a 8 litros de sangue

Clulas sanguneas

Hemcias Leuccitos Trombcitos (plaquetas)

Fig.2- Electromicrografia de elementos figurados do sangue.

Hemcias Morfologia
Disco bicncavo; Superfcie / Volume Anucleada, sem organelos, no se dividem, nem regeneram Dimetro de aprox. 7,5m

Fig. 3- Esquema evidenciando o formato bicncavo dos eritrcitos.

Hemcias

Funo
Fig. 4- Fotomicrografia demonstra o aspecto caracterstico de hemcias num esfregao de sangue.

Transporte de O2 , CO2 atravs da hemoglobina Responsveis pelo poder tampo do sangue Possuem na membrana plasmtica externa com antignios especficos 120 dias de vida

Leuccitos
Granulcitos (grnulos visveis no citoplasma) Neutrfilos Eosinfilos Basfilos
Agranulcitos ( grnulos no visveis no citoplasma) Linfcitos Moncitos

Fig.5- Fotomicrografia representado a morfologia dos diferentes leuccitos.

Granulcitos- Neutrfilos
Morfologia

Ncleo pollobado Entre 12 - 14m

Citoplasma levemente pontilhado por grnulos

Fig.6- Fotomicrografia mostrando a morfologia de um neutrfilo maduro.

Granulcitos- Neutrfilos

Funo

Fig.7- Fitomicrografia de um neutrfilo com 5 lbulos.

Primeiros a chegar s reas de inflamao (diapedese) Grande capacidade de fagocitose (digesto enzimtica) Defesa contra bactrias e fungos

Granulcitos- Eosinfilos

Morfologia
Entre 12 - 17 m
Fig.8- Fotomicrografia de um eosinfilo cujo ncleo bilobulado parcialmente obscurecido pelos grnulos citoplasmticos densamente agrupados.

Ncleo bilobulado

Citoplasma acidfilo com muitas granulaes (grandes e especificas)

Granulcitos- Eosinfilos Funo

Fagocitose de complexos antignio-anticorpo e agentes patognicos

Atrados pela histamina

Quimiotaxia (tecidos)

Rico em peroxidase levando neutralizao da histamina

Papel anti-inflamatrio

Granulcitos- Basfilos

Morfologia
Entre 14 - 16 m

Fig.9- Fotomicrografia de um basfilo cujo ncleo bilobulado obscurecido por numerosos grnulos especficos grandes, densamente basfilos.

Ncleo volumoso, irregular e retorcido em forma de S (bilobulado)

Grnulos citoplasmticos volumosos que chegam a cobrir todo o ncleo

Granulcitos- Basfilos

Funo
Capacidade fagocitria (reduzida)

Libertam histamina e heparina, atraindo outros linfcitos

Aco de sensibilidade imediata

Agranulcitos- Linfcitos

Morfologia
Fig.14- Fotomicrografia ilustrando um linfcito grande(poro citoplasmtica facilmente visvel.

Ncleo grande e redondo, densamente corado Quantidade pequena de citoplasma basfilo no granular Entre 6-15 m (mais pequeno dos leuccitos)

Agranulcitos- Linfcitos

Funo
Dois tipos de funo imunitria, associadas a 2 tipos de clulas derivadas da medula ssea:
Imunidade humoral, atribuda aos linfcitos B

Sofrem maturao para plasmcitos

Produtores de anticorpos especficos

 Funo
Dois tipos de funo imunitria, associadas a 2 tipos de clulas derivadas da medula ssea:
Imunidade celular, atribuda aos linfcitos T

Sofrem maturao no timo Actuam directamente no combate de agentes patognicos Estimulam / inibem a resposta mediada por anticorpos

Sofrem maturao para: linfcitos T auxiliares linfcitos T citotxicos linfcitos T supressores linfcitos T de memria

Agranulcitos- Linfcitos
Grande linfcito
Entre 9 15 m Citoplasma facilmente visvel, com algumas granulaes Constituem linfcitos B ou T activados a caminho dos tecidos
P

Pequeno linfcito

Aproximadamente 6 9 m Fig.10- Fotomicrografia ilustrando um linfcito pequeno (citoplasma escasso) Ncleo muito grande e um linfcito grande(poro citoplasmtica facilmente visvel). Citoplasma muito reduzido, sem granulaes e muito basfilo Predominncia no sangue circulante

Agranulcitos- Moncitos

Morfologia
Fig.16- Fotomicrografia ilustrando um moncito cujo ncleo evidencia uma endentao da face do mesmo dando-lhe um aspecto de ferradura.

Clulas de grande tamanho: 16 20 m Ncleo grande e excntrico, em forma de rim Citoplasma extenso, com colorao acastanhada, granulaes azurfilas numerosas e pouco visveis

Agranulcitos- Moncitos

Funo

Fig.17- Fotomicrografia ilustrando moncitos num granuloma pulmonar.

Clulas fagocitrias de vrus, bactrias e fungos

Percursoras dos macrfagos, encontrados nos rgos e tecidos perifricos

Leuccitos
Assim, as percentagens relativas normais leuccitos no sangue so, aproximadamente:
Neutrfilos - 60% Linfcitos - 32% Moncitos - 6% Eosinfilos - 2% Basfilos - 0,5%

de

A alterao deste valores pode dar indicao de patologias no organismo

Trombcitos/plaquetas

Morfologia e Funo
Fig.11- Fotomicrografia de trombcitos num esfregao de sangue (onde a sua forma no visvel claramente.

Fragmentos celulares anucleados, provenientes megacaricitos da medula ssea (8 a 10 dias) Manuteno do processo natural de homeostasia Vitais no processo de coagulao e reparao vascular

dos

Formao de cogulos

Fig.12- Esquema explicativo da formao de um coagulo(actuao da fibrina).

A Determinao do Hematcrito Por centrifugao observa-se que as clulas sanguneas ocupam um pouco menos de metade do volume total do sangue 47% no homem e 42% na mulher

Determina-se essa percentagem com a ajuda de um tubo de centrifuga graduado, o hematcrito

3000 rpm 5min

altura.ocupada. pelas.hemcias hematcrito altura.ocupada. pelo.sangue

Fig.13 : Hematcrito

B Contagem dos glbulos vermelhos

Fig.15 : Cmara de Neubaeur.

Fig.14 : Pipeta de diluio do sangue para contagem dos glbulos vermelhos.

Fig.16 : Esquema para a colocao da soluo na cmara de Neubaeur.

Cmaras de contagem

Fig.17: Esquema da cmara de contagem

1 5 3

Glbulos vermelhos por mm3 de sangue

1/50 mm3 ----------- n total de glbulos vermelhos contados 1 mm3 ----------- X glbulos vermelhos

X = 50 x n total de glb. verm. Contados X = 50 x n total de glb. verm. Contados x 200=

factor de diluio

X = 10000 x n total de glb. verm. Contados

Valores de referncia: homem:5.200.000( 800.000) GV/mm3 mulher:4.500.000 (500.000) GV/mm3

C Contagem dos glbulos brancos

Fig.25 : Pipeta de diluio do sangue para contagem dos glbulos brancos.

Glbulos brancos por mm3 de sangue

0,4 mm3 ----------- n total de glbulos brancos contados 1 mm3 ----------- X glbulos brancos

X = n total de glb. brancos contados 0,4

factor de diluio

X = n total de glb. brancos contados x 20= 0,4

X = 50 x n total de glb. brancos contados Valores de referncia: 70002500 GB/mm3

D Contagem diferencial dos glbulos brancos

2a3 minutos

- Escorrer o corante; - Lavar com gua destilada; - Remover excesso de gua;

- Secar.

4 minutos

Contagem dos leuccitos:

E Determinao dos grupos sanguneos

A classificao dos diversos sistemas de grupos sanguneos estabelece-se em funo da presena ou ausncia de determinados antignios na superfcie dos eritrcitos; Sistema ABO e Rhesus so os mais importantes e investigados antes de se proceder a uma transfuso sangunea.

Tipo sanguneo

Gentipo

Aglutinognio (eritrcitos)

Aglutinina (plasma)

IA IA ou IA i

Antignio A

(anti-B)

IB IB ou IB i

Antignio B

(anti-A)

IA IB

Antignio A e B

Sem aglutininas ou

ii

Sem antignio A ou B

 As aglutininas e no podem existir num sangue que possua antignios correspondentes na superfcie dos seus eritrcitos;
Caso contrrio

Reao antignio-anticorpo
Consequncia

 Transfuses sanguneas

 Segundo sistema mais importante a ter em conta nas transfuses sanguneas;

Indivduos com antignio Rhsus Indivduos sem antignio Rhsus

Rh+
produzem anticorpos anti-Rh (aps exposio ao antignio)

Rh-

Existem vrios antignios Rhsus (C, D, E);

Anticorpo anti-D o normalmente usado para a determinao Rh do sangue.

Verificar presena ou ausncia de aglutinao

Anti-A

Anti-B

Anti-AB

Anti-D

Grupo sanguneo

A+ AB+ BAB+ ABO+ O-

Reao de aglutinao

Bioanlise / Ano II N. 2 Jul/Dez - 2005

ARTIGO ORIGINAL

Enumeration of T CD3, CD4 and CD8 Lymphocytary Populations in a Haematological Counter and Comparison with Flow Citometry
*SUSANA

SANTOS1, ROGRIO BARREIRA1, CATARINA SILVA PINTO1, PAULA PINA CABRAL1, MANUELA FORTUNA1, CRISTINA MENEZES1, GABRIEL TAMAGNINI1
1Servio

de Hematologia, Centro Hospitalar de Coimbra

Objectivo de estudo

Comparao entre duas metodologias

- Immuno T-Cell CD3/4/8 e Citometria de Fluxo - para contagem de linfcitos CD3, CD4, CD8.

Avaliao da correlao e da concordncia entre ambas.

Introduo

HIV apresenta um tropismo selectivo em relao s clulas do sistema imunitrio Supresso gradual dos linfcitos T CD4 Infeces oportunistas Preveno e tratamento depende directamente do nmero de linfcitos T circulantes

Citometria de fluxo

Estudo das diferentes populaes linfocitrias

Identificao de antignios na membrana celular dos linfcitos

Imunofluorescncia

Anticorpos esto conjugados com fluorocromos, que ao serem excitados por um feixe luminoso, emitem radiaes com diferentes comprimentos de onda.

Imunofluorescncia

Citometria de fluxo

Immuno T-Cell Assay

FacsCalibur

Cell Dyn 4000

Immuno T-Cell Assay

Citometria de fluxo

- Feixe luminoso diferente. - Optimizao do programa.

Materiais e Mtodos
Foram estudadas 51 amostras de sangue perifrico de doentes seguidos no Centro

Hospitalar de Coimbra, divididas por 4 grupos:

grupo controlo, grupos de doentes com linfocitoses, doentes VIH positivo e doentes VIH

positivo com valores de CD4 abaixo das 200

cl./L.

Citometria de Fluxo (FACSCalibur)

Immuno T-Cell Assay (CELL--DYN 4000)

Avaliao Estatstica:
Programa Stat-View (t-Student, correlao de Pearson )
Correlao

Teste de Bland Altman

Concordncia

Resultados & Discusso

T-Student Pearson
No existncia de diferenas de mdias estatisticamente significativas para todos os grupos estudados.

Boa correlao para os quatro grupos estudados.

Os coeficientes de concordncia, tambm, permitiram verificar que ambas as metodologias, Immuno T-Cell CD3/4/8 e citometria de fluxo, so concordantes para todos os grupos analisados.

Citometria de Fluxo
dispendiosa, morosa e exige um manuseamento relativamente prolongado por parte do operador.

Immun T-Cell Assay

Todo o procedimento realizado com a mesma amostra, na mesma determinao e demora apenas 7 minutos.

Duas amostras para a determinao dos parmetros hematolgicos e para a citometria de fluxo, o que aumenta as probabilidades de erro e o consumo de material e reagentes.
Contadores hematolgicos para contagens em nmeros absolutos dos linfcitos a partir dos quais calcula os valores das populaes linfocitrias.

Fig.25: Scatter obtido ao utilizar a metodologia Immuno T Cell, mostrando os clculos automaticamente efectuados, tanto para valores absolutos como para percentagens.

Observao menos positiva

Verificou-se que no grupo de doentes VIH positivos em 15 indivduos estudados, 5 (33%) seriam includos no protocolo de terapia anti-retroviral quando analisados por citometria de fluxo, no entanto quando analisados pelo CELLDYN 4000, s 3 destes doentes, ou seja 20% seriam includos, ficando 2 (13%) dos indivduos excludos do protocolo para tratamento.

Concluses
Para possvel estabelecimento de teraputica, talvez fosse aconselhvel a determinao destes valores por ambas as metodologias, para confirmao dos resultados obtidos. Indiferente a utilizao de qualquer uma das metodologias em causa.

Vantagens na introduo e utilizao na rotina laboratorial do mtodo ImmunoT-Cell Assay como: - celeridade; - calcular directamente todos os valores; - diminuio dos riscos de contaminaes por parte do operador.

http://fei.edu.br/~rbianchi/publications/RevistaFEI2004-a.pdf http://boasaude.uol.com.br/exam/index.cfm?lookup=H&ExamID=63&View=View http://www.mdsaude.com/2009/11/hemograma.html Enumeration of T CD3, CD4 and CD8 Lymphocytary Populations in a Haematological Counter and Comparison with Floow Citometry ,Susana Santos, Rogrio Barreira, Catarina Silva Pinto, Paula Pina Cabral, Manuela Fortuna, Cristina Menezes, Gabriel Tamagnini, Bioanlise/ Ano II . N 2. Jul/Dez 2005 Barbara Young, James S Lowe, Alan Stevens, John W Heath.;WHEATERS FUNCTIONAL HISTOLOGY A TEXT AND COLOUR ATLAS., Elsevier (Churchill Livingstone). , 2006 Valente L.usa M.; Carrilho Ana.I.,Trabalhos Prticos de Laboratrio de Bioqumica e Fisiologia Animal., ICBAS.,2011-2012 Rocha, Eduardo; Silva, Paula; Fleming, Ana Carolina; Monteiro, Rogrio, Manual De Aulas Terico- Praticas;; Departamento de Microscopia e Laboratrio de Histologia e Embriologia, Instituto de Cincias Biomdicas Abel Salazar da Universidade do Porto., Edio de 2009/2010

No fique de fora, seja um dador