LABORATORIO CLINICO MICROBIOLOGIA SANDRA SNCHEZ

Deteccin de Mecanismos de resistencias de Bacilos Gram Negativos No Fermentadores

Las tres especies de bacilos gramnegativos no fermentadores ms relevantes clnicamente:  Pseudomonas aeruginosa  Acinetobacter baumannii,  Stenotrophomonas maltophilia, Son frecuentemente multirresistentes

La resistencia en P. aeruginosa depende de

Betalactamicos Produccin de betalactamasa cromosmica Betalactamasa plasmdicas Alteraciones de la permeabilidad (perdida de la porina OprD Alteraciones en la bombas de expulsin activa. Aminoglucsidos Quinolonas

Produccin de enzimas Alteraciones de la inactivantes topoisomerasas Bomba de expulsin MexXY-OprM. Alteraciones de las porinas Bombas de expulsin actica

En el Acinetobacter baumannii
Betalactamicos Produccin de betalactamasas Alteraciones en protenas fijadoras de penicilinas Aminoglucsidos Se ha relacionado con protenas modificantes Quinolonas Con alteraciones de la dianas

En Stenotrophomonas maltophilia
 Presenta resistencia natural a las carbapenemas, y

otros betalactmicos por produccin de dos betalactamasas (L-1 Y L-2).

 Tambin en esta especie se han descrito enzimas

modificantes de aminoglucsidos

Betalactamasas involucradas en la resistencia a carbapenens

 Las dos betalactamasas que con mayor frecuencia

pueden llevar a resistencia a los carbapenem son las del grupo AmpC y las carbapenemasas . Son tambin llamadas cefalosporinasas, median la resistencia a las cefalosporinas de tercera generacin, aztreonam, cefemicinas (cefoxitin, cefotetn), e inhibidores de betalactamasas.

 Betalactamasas de tipo AmpC.

La Pseudomonas aeruginosa y el Acinetobacter baumannii, poseen el gen AmpC en los cromosomas 11, 12 . Estas bacterias presentan un sofisticado sistema molecular que regula la expresin del gen, de tal modo que solo se sintetiza la betalactamasa cuando es necesaria. El sistema funciona de la siguiente manera: la expresin del gen AmpC es inducida por protenas AmpR, la cual adquiere funcionalidad en presencia de los productos

de degradacin de la pared bacteriana, de esta manera, cuando la degradacin de la pared bacteriana es alta, la AmpR se activa e induce la produccin de la betalactamasa. En estas bacterias, la alta concentracin de la enzima AmpC, asociada con la perdida porina o la expresin exagerada de bombas de flujo, es suficiente para desarrollar resistencia a los carbapenem ACT-1, CMY-4 y, recientemente, ACC-1 (14, 17, 19).

BETALACTAMASAS DE TIPO CARBAPENEMASAS Metalo-betalactamasa cationes divalentes, tipo zinc, como cofactor

Tipo serina Residuo de serina en el sitio activo

Clase A
NMC A SME 1- 3 IMI 1 E. Cloacae S. marcescens KPC 1- 3 K. pneumoniae GES 2 P. aeruginosa

Clase D
Tipo OXA A. baumannii

Clase B Tipo IMP Tipo VIM SPM 1 GIM-1

Presentan una gran actividad hidroltica contra aminopenicilinas, ureidopenicilinas, aztreonam y los carbapenem y baja actividad hidroltica contra las cefalosporinas de tercera generacin

Betalactamasas. Tcnicas de Deteccin

 El fundamento de la deteccin es enfrentar las

bacterias en estudio con los preparados betalactmicos para poner en evidencia la mayor o menor estabilidad de stos frente a las betalactamasas.  Los mtodos usados varan segn la especie a estudiar, el antibitico a ensayar y el tipo de enzima a detectar.  Diferencias entre BGP y BGN

Betalactamasas. Tcnicas de Deteccin. Tipos

 Esta prueba utiliza tiras que contienen, en una parte de ella

diferentes concentraciones decrecientes de la cefalosporina (ceftazidima) y en la otra parte la misma cefalosporina con una concentracin fija de acido clavulnico. Las tiras deben ser colocadas en al agar Mueller Hinton.

 La CIM se determina observando el punto en que la elipse de

inhibicin intercepta la escala de la tira. Se lee el extremo del antibitico sin el acido clavulnico y el extremo que contiene acido clavulnico, se divide las dos concentraciones en ese orden y un resultado positivo para BLEE es cuando la proporcin es 8 y negativo<8.

 Cuando el crecimiento tiene lugar a lo largo de toda la tira y

no se observa formacin de la elipse de inhibicin, la CIM ser el valor superior que tiene la tira y por el contrario, cuando la elipse de inhibicin se encuentre por debajo de la tira debe informar el valor mnimo de la escala.

Distribucin de los discos para detectar BLEE y AmpC

Placa 1: y cefalotina (CEF), gentamicina (GEN), y amikacina (AMK), ciprofloxacina (CIP), trimetoprima/sulfametoxazol (TMS) y ampicilina (AMP). Placa 2: amoxicilina/ac. clavulnico (AMC), cefotaxima (CTX), imipenem (IMP), meropenem (MER), piperacilina/tazobactam (TAZ) y ceftazidima (CAZ), y La distancia sugerida entre las cefalosporinas de tercera generacin y AMC debera ser de aproximadamente 2,5 a 3 cm, de borde a borde, para detectar ms eficientemente las BLEE

TAMIZAJE
y

y y

Resistencia o sensibilidad intermedia a Cefotaxima (CTX) o Ceftazidima CAZ con la deformacin del halo de inhibicin de cualquiera de las cefalosporinas de tercera generacin en las cercanas de AMC se considera prueba confirmatoria de BLEE Excepcin 1: aislamientos productores de BLEE con alto nivel de resistencia donde la deformacin puede no observarse. Excepcin 2: sensibilidad a CTX y CAZ con deformacin del halo de inhibicin. Ambas excepciones requieren confirmacin.

Mtodo automatizados : Permite la deteccin inicial de B-lactamasas por la resistencia a cualquier cefalosporina de amplio espectro y el reporte de resistencia extendida a todas las cefalosporinas 1. Discos de Cefotaxima (CTX); y Cefotaxima-Ac. Clavulnico (CTC) o entre los de Ceftazidima (CAZ); y CCV 2. Tiras de E-test para deteccin de BLEE: CTX-CTC y CAZ-CCV. 3. CIM en medio slido o lquido para CTX, CTC, CAZ y CCV. Caracterizacin de la enzima (PCR, hibridacin con sondas especficas de familia, punto isoelctrico, secuenciacin de ADN.
1.

Prueba de Disco para AmpC

 Esta prueba esta basada en el uso de un disco que contiene Tris-EDTA

para permeabilizar la clula de la bacteria y permitir la liberacin de la Lactamasas al ambiente externo.  Los discos AmpC se preparan aplicando 20 l de una mezcla 1:1 de TrisEDTA 100X y solucin salina fisiolgica estril (SSFE), a discos de papel de filtro previamente esterilizados. Una vez preparados se dejan secar y se guardan en refrigeracin hasta su uso.  Seguidamente, se inocula una placa con agar Mueller-Hinton segn el mtodo de difusin con discos, con la cepa ATCC 25922 de E. coli. Los discos preparados en el paso anterior, se rehidratan con 20 l de SSFE y se le aplicancolonias de la cepa a estudiar.  Posteriormente, se coloca un disco de cefoxitina (30 g) y, los discos AmpC ya inoculados, se ubican muy cercanos pero sin tocar el borde del disco de cefoxitina. La aparicin de una distorsin de la zona de inhibicin, indica inactivacin de la cefoxitina por parte de la AmpC (AmpC +), y la ausencia de distorsin representa un resultado negativo (AmpC -).

Prueba tamiz y confirmatoria para sospecha de carbapenemasas Test de Hodge Modificado

Esta prueba analiza la actividad de las enzimas tipo carbapenemasas en clulas intactas del microorganismo a probar. Prueba tamiz por mtodo de difusin en disco  Discos de meropenem y ertapenem de 10 g  Incubacin 352C en aerobiosis por 16-18horas  Sospecha de carbapenemasa: Dimetro del halo meropenem 16-21mm Dimetro del halo ertapenem 19-21mm  Se debe confirmar con el test de Hodge  No utilizar disco de imipenem porque es pobre predictor de carbapenemasas  Control de calidad: E. coli ATCC 25922