Edgar Javier Snchez Romn Dra.

Mara Calixta Martnez Vzquez

Diagnstico de las Infecciones virales

La serologa se refiere al uso de las reacciones antgeno: anticuerpo para el diagnstico de una infeccin. Clsicamente, la serologa se ha usado para la deteccin de anticuerpos en el suero, pero igualmente puede usarse para la deteccin de antgenos en el suero y de Acs o Ags en cualquier de lquido corporal (por ejemplo, el lquido cerebroespinal (LCR), saliva, etc.)

Signos y sntomas clnicos por el mdico Deteccin Viral (partculas, Ags, genomas etc) Deteccin de la exposicin al Virus (respuesta inmune al virus IgG, IgM)

Aislamiento en animales, cultivos celulares. Microscopa electrnica e IEM Hemaglutinacin o hemadsorcin ELISA Deteccin inmunolgica (Inmunohistoqumica Inmunofluorescencia) PCR y RT-PCR (Mtodos moleculares) Hibridizacin Otras pruebas Cuantificacin Viral (UFP, DICC50%)

 Deteccin de anticuerpos contra el virus en suero u otros fluidos corporales.

Neutralizacin viral Fijacin de complemento Inhibicin de la Hemaglutinacin ELISA, Inmunofluorescencia Radioinmunoensayo Western blot Otras.

Cultivos celulares

Efecto citoptico

Deteccin por IF y otras pruebas Identificacin por pruebas serolgicas con antisueros especficos

Enfermedad Parlisis Encefalitis Muerte Otros efectos Animales de laboratorio

Titulacin de anticuerpos o antgenos virales

Es una manera corriente de determinar la presencia o ausencia o la cantidad relativa de anticuerpos o antgenos en una muestra y representarla por medio de un valor nominal o numrico. Para esto se hacen diluciones seriadas de la muestra y luego se realiza la prueba serolgica mas adecuada en cada caso. El recproco de la dilucin ms alta de la muestra que da una reaccin positiva se informa como el ttulo del suero.

Neutralizacin viral Fijacin del Complemento Difusin en gel de agar Inhibicin de la hemoaglutinacin (HI) ELISA Otras

Prueba de Neutralizacin (Nt)

La neutralizacin mide actividad biolgica del virus por lo tanto requiere de virus vivos para poder realizarse. Igualmente, se realiza en un sistema vivo.
El principio bsico de la prueba de Nt es la inhibicin (neutralizacin) de la infeccin viral a la clula (cultivo o animal) por medio de los Acs especficos, por lo tanto se neutraliza la accin del virus sobre el hospedero. La Nt tiene 4 variantes con respecto a suero (Acs) y virus (Ag).

Prueba de Neutralizacin (Medicin de anticuerpos, inmunidad).

Virus de referencia 100 DICT50 a todas las dils.

C. suero 128 64 32 16 8

C. virus

C. cls.

Cultivo celular Susceptible a todos los pozos

37C 5%CO2
Varios das

Dils sueros

4 2
1A 1C 2A 2C 3A 3C
Muestras de suero agudo y Convaleciente por duplicado

30 min T amb.

Observacin diaria al M. invertido

Sueros pacientes 1, 2 y 3 diludos (Acs?).

LECTURA

Coloracin con Cristal violeta para conservar el microplato o facilitar la lectura.

Neutralizacin No hay ECP Presencia de Acs especficos

No neutralizacin Presencia de ECP No hay Acs especficos en esa dilucin del suero.

EJEMPLO: LEER E INTERPRETAR ESTA PRUEBA DE NEUTRALIZACIN. (ANTICUERPOS ANTI- POLIOVIRUS 1)

1:2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 CS C O N T C E L

PACIENTE 1

PACIENTE 2

PACIENTE 3 SUERO AGUDO

C. V I R U S

1 0 0 D I C T 50

PACIENTE 3 SUERO CONVALECIENTE

EJEMPLO 2: LEER E INTERPRETAR ESTA PRUEBA DE NEUTRALIZACIN. (TIPIFICACIN DE AISLAMIENTOS DE POLIOVIRUS)

CONTROL MEDIO DE CULTIVO

CONTROL ANTISUERO ANTI-POLIO 1

CONTROL ANTISUERO ANTI-POLIO 2

CONTROL ANTISUERO ANTI-POLIO 3

CONTROL CLULAS AISLAMIENTO 10 AISLAMIENTO 9 AISLAMIENTO 8 AISLAMIENTO 7 AISLAMIENTO 6 AISLAMIENTO 5 AISLAMIENTO 4 AISLAMIENTO 3 AISLAMIENTO 2 AISLAMIENTO 1

CONTROL CLULAS

Neutralizacin

Prueba de Inmunodifusin en Gel de Agar (AGID) o ID doble.

El principio bsico de la Immunodifusin en Gel de Agar (AGID) es que las protenas (Acs y Ags) tienen la propiedad de difundirse a travs de un medio semislido (agar). Si se ubican en el gel en forma adecuada, ambos, Ag y Ac se encontrarn en un punto equidistante y all se formar una lnea de precipitado constituda por los complejos Ag:Ac.

Prueba de Inmunodifusin
perforador
Pipeta pasteur El lquido desciende por gravedad

Medio semislido Agar, agarosa

Pozos equidistantes

PATRONES DE LECTURA

La precipitacin ocurre solo cuando las proporciones de Ags y Acs son ptimas. No ocurre cuando hay exceso de cualquiera de los dos reactantes.

IMMUNODIFUSIN RADIAL
Variante de la ID que se usa para medir las concentraciones de inmunoglobulina en suero. El agar se mezcla con una anti-inmunoglobulina especfica para una clase (o subclase) de inmunoglobulina de inters. En los pozos cortados en el agar se pone la muestra del suero y se incuba 24-48 h. para permitir su difusin. Al difundir el suero, ir formando complejos inmunes con el antisuero del agar y se precipitar en forma de anillo alrededor del pozo. Como la concentracin del antisuero es constante, el dimetro del anillo es proporcional a la concentracin del Ag (inmunoglobulina de suero). Para cuantificar, se mide el dimetro del anillo y se compara con estndares o una curva de concentracin de Igs.

IgM total

Prueba de Fijacin del Complemento (CF)

El principio bsico de una prueba de fijacin de complemento es la activacin y el consumo (fijacin) del complemento en presencia de una reaccin Ag:Ac especfica.
El sistema de deteccin usado es la lisis de GR en la presencia del antisuero especfico para los GR (sistema hemoltico) si el complemento no se consume en la reaccin Ag:Ac inicial.

Prueba de Fijacin del Complemento (CF)

En la mayora de las reacciones Ag-Ac, el C se une al complejo y es usado o fijado. Este proceso puede usarse para detectar cantidades muy pequeas de Acs. Su ejecucin requiere de gran cuidado y buenos controles. Se hace en dos etapas: la fijacin del C y el revelado de la reaccin con el sistema hemoltico. Actualmente, se ha ido remplazando por pruebas que requieren menos manipulacin y que pueden se automatizadas.

Prueba positiva
Ag Glbulos Rojos de carnero

Prueba negativa
Ag

Glbulos Rojos de carnero Acs antiGRC

revelado

Primera reaccin

Sistema hemoltico

Primera reaccin

Suero con Acs revelado

Acs antiGRC

Suero sin Acs

Sistema hemoltico

Complemento

Complemento

Fijacin del C No hemlisis. El C se gast En la 1 reaccin.

NO Fijacin del C Hemlisis. El C qued libre Para la 2 reaccin

 Toma de las muestras cuando no ocurri exposicin o en un perodo inadecuado Tiempo necesario en algunas pruebas Para correlacin con enfermedad - Sueros pareados - IgM vs IgG - Lquido cefalorraqudeo

Otros- Microscopa de luz

Tinciones especiales: Wright o Giemsa, HyE en extendidos provenientes de lesiones o en cultivos celulares con laminilla. Se visualizan las inclusiones o los cambios celulares ocasionados por la invasin viral: Ej: Inclusiones producidas por el citomegalovirus (CMV) en sedimento urinario, inclusiones nucleares o citoplasmticas, sincitios, cuerpos de inclusin. Prueba de Tzanck para observar las clulas infectadas por herpes o varicela zster (raspado de la base de las vesculas, se observan las clulas, que se tornan agrandadas, con mltiples ncleos puede haber inclusiones intranucleares).

Test de Tzanck

Corpsculos de Negri en cerebro. Virus rbico

Formacin de Sincitios H/E