Qumica

tBu Fmoc/

SNTESE DE PEPTDEOS EM FASE SLIDA (SPFS)

Aline B. Guimares e Daniel Logrado Laboratrio de Bioqumica e Qumica de Protenas junho/2012

SPFS E MERRIFIELD

Ligao de aminocidos um suporte slido adio de novos resduos de aminocidos por reaes de acoplamento sntese do peptdeo desejado ;

1963 = sntese de um tetrapeptdeo, usando um suporte slido poroso (trabalho polmico metodologia questionada produo de impurezas?)

1964 = sntese e purificao de um nonapeptdeo em cinco dias revolucionou as estratgias de sntese de peptdeos da poca !!

Por sua concepo, o cientista foi agraciado com o Nobel

ROBERT BRUCE MERRIFIELD (1921-2006)

de Qumica em 1984!

Gly-Leu-Leu-Asp-Thr-Leu-Lys-Gly-Ala-Ala-Lys-AsnVal-Val-Gly-Ser-Leu-Ala-Ser-Lys-Val-Met-Glu-LysLeu-NH2

CASO PRTICO Sntese de Anlogo do peptdeo Pentadactylin

16 resduos Gly, Leu, Lys, Ala, Asn,Val e Ser

http://amphibiaweb.org/cgi/amphib_query?where-genus=Leptodactylus&where-species=pentadactylus

SINTETIZADOR DE PEPTDEOS PSSM-8 - SHIMADZU

VASO DE REAO
NovaPEG Rink Amide resin

Compatvel com a estratgia Fmoc; O peptdeo sintetizado com a poro C-terminal amidada.

CARACTERSTICAS DA RESINA

Partculas quimicamente inertes a todos os solventes e reagentes usados durante todo o processo de sntese;

No deve interagir com a cadeia peptdica;

Facilidade de modificao qumica = o primeiro

aminocido (da sequncia) deve conseguir se ligar eficazmente ao suporte; Capacidade de inchar = aumento da rea tornar os pontos de reao acessveis aos solventes e

LINKER - ESPAADOR
Na sntese Fmoc/tBu, as condies de clivagem no so suficientemente agressivas para quebrar a ligao entre os aminocidos e a resina importncia do linker. Ligao entre o peptdeo e o linker: estvel a tratamentos repetitivos remoo do grupo protetor temporrio e acoplamento dos aminocidos; deve permitir, ao final da sntese a clivagem da ligao peptdeo-resina sem danificar o produto final.

FORMAO DA LIGAO PEPTDICA

Competio pode gerar produtos indesejveis!

Leu

Gly

Gly Leu

ACOPLAMENTO
No

sentido de promover a reao entre o aminocido a ser adicionado sequncia peptdica e o ltimo resduo da cadeia (j desprotegido), necessrio ativar previamente o grupo carboxlico livre do aminocido a incorporar.

uso de agentes de acoplamento possibilita o aumento da rapidez de reao (mesmo entre aminocidos estericamente impedidos) e a supresso ou minimizao de reaes laterais.

ACOPLAMENTO

Racemizao no carbono alfa (carboxila) a formao de subproduto (diasterismero) pode ser evitada com a adio de grupos de proteo!!

DMF

NMM Em DMF

GRUPOS DE PROTEO - TIPOS

TEMPORRIO = para aqueles que formam a ligao peptdica (Fmoc); PERMANENTE = para grupos funcionais dentro de cada cadeia lateral (estes devem ser muito estveis para suportarem a remoo dos GPT).

CADEIA LATERAL = H, ALQUILA, ARILA

Sem grupo de proteo !

CADEIA LATERAL = OH OtBU

CADEIA LATERAL = COOH COOtBU

CADEIA LATERAL = CONH2Trt

CADEIA LATERAL = SH DEPENDE...

CADEIA LATERAL = GRUPOS BSICOS E IMIDAZOL

SADA DO GRUPO Fmoc DO N-TERMINAL

PIPERIDINA

9 CICLOS DEPOIS...

7 CICLOS DEPOIS...

EXTRAO DOS PEPTDEOS

EXTRAO DOS PEPTDEOS

Durante o processo so geradas espcies catinicas altamente reativas que podem, a menos que impedidas, reagir e modificar resduos que contm grupos funcionais nucleoflicos (Trp, Met, Tyr e Cys).

Uso de reagentes nucleoflicos (scavengers) para capturar os ctions e impedir tais reaes.
Reagentes: anisol, o p-cresol, o etan-1,2-ditiol, o sulfureto de dimetilo e trialquilsilanos.

CLIVAGEM DOS GRUPOS PERMANENTES

Remoo do grupo de proteo do resduo Asn em condies cidas radical tritila confere a mudana na cor da soluo!

Coleta

PURIFICAO E CARACTERIZAO DOS PEPTDEOS SINTTICOS

Avaliao : cromatografia lquida;

Espectrometria de massas = confirmao da sequncia;

RMN = identificao estrutural e investigao do comportamento conformacional.

INDICA SE A SNTESE/PURIFICAO FOI BEM SUCEDIDA GRAU DE CONFIABILIDADE DO MATERIAL SINTTICO.

CROMATOGRAMA

CONSIDERAES FINAIS
Vantagens

Desvantagens

Suporte polimrico insolvel Fcil remoo de material de partida ou subprodutos no ligados resina lavagem a cada etapa Pode-se utilizar excesso de reagentes aumento do rendimento Purificao rpida e parcial a cada etapa Possibilidade de automatizao = combinao de velocidade e praticidade

Reaes incompletas e modificaes qumicas das cadeias lateraiscontaminantes Possibilidade de agregao: associao intercadeias peptdicas

Racemizao provocada pela necessidade de ativar a carboxila alfa dos aminocidos em meio bsico para a formao da ligao peptdica
No suporta sntese de longas sequncias.

RENDIMENTO

No 100%, mas tentamos aumentar a quantidade de peptdeo sintetizado com o uso de um excesso de reagentes isso no

problema, pois o
excesso lavado a cada etapa!

REFERNCIAS

Machado, A., et al. SNTESES QUMICA E ENZIMTICA DE PEPTDEOS: PRINCPIOS BSICOS E APLICAES .Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 781-789, 2004. ESTUDO DA SNTESE CONVERGENTE DE PEPTDEOS EM FASE SLIDA: ABORDAGEM CLSSICA E USO DE TEMPERATURA ALTA. - Csar Manuel Remuzgo Ruiz.: Dissertao de Mestrado USP, So Paulo, 2003. APPLIED Biosystems Technical Bulletin Cleavage, Deprotection, and Isolation of Peptides after Fmoc Synthesis The Chemical Synthesis of Peptides http://nzic.org.nz/ChemProcesses/biotech/12E.pdf A NEW CONCEPTION OF POLYMERIC SUPPORTS FOR THE SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS: RIGIDITY AND POROSITY AS DETERMINANT FACTORS FOR THE SUCCESS IN INDUSTRIAL APPLICATIONS Sara Cantone. Tese de Doutorado: Universit degli studi di Triest, Itlia, 2008. Advanced Automated Peptide Protein Technologies Coupling Reagents Thttp://www.aapptec.com/broch/Coupling%20Reagents.pdf SNTESE DE PPTIDOS ENVOLVIDOS EM MECANISMOS DE ACO ANTIBITICA - Slvia Maria da Silva Pereira Faria. Dissertao de Mestrado: Faculdade de Cincias, Universidade do Porto, 2003 Organic Chemistry - Clayden, Jonathan; Warren, Stuart; Wothers, Peter; Clayden, Jonathan ; Greeves, Nick.
Editora: Oxford Univ Press Usa

Organic synthesis in drug discovery http://userwww.sfsu.edu/~cberkman/640_org_synth_drug_discov_1.pdf

Muito obrigada!!!